Noticias

Jul 09, 2023

DprE2 es un objetivo molecular del anti

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 3828 (2023) Citar este artículo 1673 Accesos 13 Detalles de Altmetric Metrics Mycobacterium tuberculosis es una de las principales causas mundiales de muerte debido a

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 3828 (2023) Citar este artículo

1673 Accesos

13 altmétrico

Detalles de métricas

Mycobacterium tuberculosis es una de las principales causas de muerte a nivel mundial debido a un solo agente infeccioso. La pretomanida y la delamanida son nuevos agentes antituberculosos que han avanzado en el proceso de descubrimiento de fármacos. Estos compuestos son nitroimidazoles bicíclicos que actúan como profármacos y requieren activación por una enzima micobacteriana; sin embargo, los mecanismos de acción precisos de los metabolitos activos no están claros. Aquí, identificamos un objetivo molecular de pretomanid y delamanid activados: la subunidad DprE2 de decaprenilfosforribosa-2'-epimerasa, una enzima necesaria para la síntesis de arabinogalactano de la pared celular. También proporcionamos evidencia de un aducto de NAD como metabolito activo de pretomanid. Nuestros resultados destacan a DprE2 como un posible objetivo antimicobacteriano y proporcionan una base para futuras exploraciones de los metabolitos activos y el desarrollo clínico de pretomanid y delamanid.

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), el agente causante de la tuberculosis (TB), ha sido clasificado como la principal causa de muerte por un solo agente infeccioso desde 2014. Aunque fue reemplazado más recientemente por COVID-19, que también ha impactado el diagnóstico y la notificación de casos, Se estima que en 2021, 10,6 millones de personas desarrollaron la enfermedad de tuberculosis activa, con 1,6 millones de muertes asociadas, lo que ejemplifica la carga mundial de la tuberculosis1,2. A pesar de una reducción gradual de la tasa de mortalidad en los últimos años, las cepas de Mtb multirresistentes (MDR) y extremadamente resistentes (XDR) continúan amenazando la eficacia de la estrategia de tratamiento actual, exigiendo la introducción urgente de nuevos agentes quimioterapéuticos y regímenes farmacológicos. . Actualmente, hay 26 medicamentos antituberculosos en ensayos clínicos de fase I, II y III y programas combinados en busca del tratamiento eficaz de las formas de tuberculosis latente, multirresistente y susceptible a los medicamentos. Estos medicamentos se componen de 17 compuestos nuevos, 6 medicamentos reutilizados y 3 que han obtenido aprobación regulatoria y se utilizan en una población selecta de pacientes con TB-MDR2. Dos de estos compuestos aprobados son los 4-nitroimidazoles bicíclicos, pretomanid (PA-824; Global Alliance for TB Drug Discovery) y delamanid (OPC-67683, Deltyba; Otsuka Pharmaceutical Company) (Fig. 1a), que han completado la fase clínica III. ensayos en terapia combinada con resultados positivos3,4. En consecuencia, la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos aprobó el uso de pretomanid en combinación con linezolid y bedaquilina en el tratamiento de infecciones específicas de tuberculosis5. Además de su potente actividad contra los aislados clínicos de MDR, la pretomanida y la delamanida son activas contra la tuberculosis no replicante6,7, lo que amplía aún más su potencial terapéutico.

a Estructuras de pretomanid y delamanid. El grupo nitro común está resaltado en rojo. b Mecanismo de activación de profármacos con ciclo redox F420. Fgd1 cataliza la oxidación de glucosa-6-fosfato a 6-fosfogluconolactona, generando F420-H2. Esta coenzima luego es oxidada por Ddn en la reducción de los profármacos pretomanid o delamanid a formas activas, regenerando F420. DprE1 cataliza la oxidación de DPR (decaprenilfosforil-D-ribosa) en un cetointermedio, DPX (decaprenilfosforil-2-cetoribosa), que posteriormente es reducido por DprE2, generando DPA (decaprenilfosforil-D-arabinosa). Los profármacos activados inhiben la reducción de DPX catalizada por DprE2. El grupo R representa el resto decaprenilo (C50).

A pesar del uso de pretomanida y delamanida en ensayos clínicos durante más de una década, sus objetivos moleculares precisos siguen siendo difíciles de alcanzar. Se ha establecido desde hace mucho tiempo que tanto la pretomanida como la delamanida son profármacos que requieren activación por la nitroreductasa dependiente de deazaflavina F420, Ddn8 (Fig. 1b), expresada únicamente en las células micobacterianas, no en el huésped. Los aislados resistentes generados clínicamente y en laboratorio exhiben mutaciones en Ddn o en uno de otros cinco genes, todos los cuales son esenciales en la activación del profármaco: fbiA, fbiB, fbiC, fbiD o fgd110,11,12. FbiA, FbiB y FbiC participan en la síntesis de F420 y Fgd1 es una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa dependiente de F420 que regenera la forma reducida del cofactor F420 para ciclos adicionales con Ddn10 (Fig. 1b). No se han documentado mutaciones en la diana molecular, lo que ha impedido avances en la validación de dianas que continúan explorándose.

La asignación de objetivos es valiosa en la progresión de los esfuerzos de la química medicinal para mejorar la eficacia, la toxicidad y el potencial de biodisponibilidad de los compuestos para uso clínico. La evidencia actual indica que la pretomanida y la delamanida tienen un mecanismo de acción multifacético, que depende de las condiciones aeróbicas y anaeróbicas, aunque aún no se han confirmado los metabolitos activos. Durante el crecimiento aeróbico, se ha demostrado que el tratamiento con pretomanid o delamanid afecta la pared celular de las micobacterias13, con una reducción de los intermediarios de micolato que apunta hacia la síntesis de ácido micólico como el objetivo probable6,7. Durante la fase de no replicación, la remodelación de la pared celular es limitada14 y se ha propuesto que las condiciones limitantes de oxígeno podrían ser un factor más importante en la intoxicación respiratoria observada causada por ambos fármacos. Se cree que esto ocurre mediante la liberación de especies reactivas de nitrógeno (como el óxido nítrico (NO) durante la activación del profármaco), que interfiere con el flujo de electrones y la homeostasis del ATP8,13,15. Sin embargo, evidencia reciente sugiere que la presencia de un eliminador de NO no afecta el efecto antimicobacteriano de delamanid en condiciones hipóxicas y no replicativas, lo que sugiere que es posible un mecanismo alternativo9.

Tras la reducción mediante Ddn, la pretomanida y la delamanida se convierten en muchos metabolitos diferentes, algunos de los cuales probablemente sean inestables y de corta duración8,9. La síntesis de los metabolitos más estables identificados ha demostrado que ninguno es activo contra la Mtb y que un derivado inestable podría representar la forma activa de los fármacos8. Los esfuerzos para identificar el metabolito activo también han dado como resultado el descubrimiento de aductos de NAD en Mtb9,16 tanto tratado con pretomanid como con delamanid. Sin embargo, no se ha observado la actividad antimicobacteriana de estos aductos de NAD, posiblemente debido a la baja permeabilidad de la membrana en estudios in vitro9.

En este trabajo, hemos identificado la enzima esencial, decaprenilfosforil-2-ceto-β-D-eritropentosa reductasa (DprE2)17, necesaria para la síntesis de precursores del componente de la pared celular arabinogalactano, como diana molecular de pretomanid y delamanida (Fig. 1). También establecemos el requisito de NAD (H) en la activación de pretomanid, lo que proporciona evidencia adicional que respalda el aducto de NAD como metabolito activo y sugiere que NADH es el cofactor natural de DprE2. Anticipamos que esta ampliación del conocimiento ayudará a futuras optimizaciones de la química medicinal y combinaciones de tratamientos directos de estos prometedores compuestos antituberculosos.

En nuestra búsqueda continua por identificar nuevos andamios químicos y objetivos farmacológicos para ayudar en el proceso de descubrimiento de fármacos contra la tuberculosis, nos esforzamos por encontrar inhibidores de objetivos no explotados dentro de la biosíntesis de la pared celular de las micobacterias. La decaprenilfosforribosa-2'-epimerasa esencial, compuesta por las subunidades DprE1 y DprE2, es responsable de la síntesis del donante de D-arabinosa ligado a lípidos, decaprenilfosforil-D-arabinosa (DPA) (Fig. 1b), que es un precursor de un constituyente importante de la pared celular, el arabinogalactano18,19,20,21. La DprE1 (decaprenilfosforil-β-D-ribosa oxidasa) es un objetivo farmacológico validado;22,23 los compuestos de benzotiazinona (BTZ), BTZ043 y PBTZ169, dirigidos a DprE1, actualmente están progresando a través de ensayos clínicos24. Debido a su farmacobilidad, DprE1 ha sido examinado exhaustivamente en busca de nuevos andamios inhibidores. Por el contrario, a pesar de su idoneidad como diana farmacológica, no se han descrito inhibidores de DprE2. Por lo tanto, mediante el uso de una pantalla basada en objetivos fenotípicos de células completas, nuestro objetivo fue identificar nuevas clases de compuestos que inhibieran específicamente DprE2. A partir de esta pantalla, identificamos una serie de resultados de compuestos que avanzaron hacia la validación del objetivo mediante la secuenciación del genoma completo de mutantes resistentes espontáneos25. Los datos revelaron mutaciones en los genes fgd1 y fbiC, comunes a las mutaciones encontradas en aislados resistentes a pretomanid y delamanid. A partir de esto, previmos que los compuestos comparten la misma vía de activación de profármacos y, por lo tanto, podrían tener potencialmente el mismo objetivo. Por lo tanto, investigamos si la pretomanida y la delamanida de hecho apuntaban a DprE2.

Inicialmente, el impacto sobre la concentración mínima inhibitoria (CMI) de pretomanida y delamanida se determinó utilizando cepas de Mycobacterium bovis BCG que sobreexpresaban Mtb DprE1 (Mt-DprE1) o Mtb DprE2 (Mt-DprE2), con un control de vector vacío (Fig. 2). Los vectores de expresión micobacterianos, pMV261 que albergan Mtb dprE1 o dprE2, se electroporaron en M. bovis BCG y se utilizó el ensayo de microplaca Alamar Blue Assay (MABA) y la enumeración de unidades formadoras de colonias (UFC) para establecer la viabilidad celular en un rango de concentraciones de fármaco. Los resultados de MABA demuestran claramente que, tras la sobreexpresión de Mt-DprE2 en comparación con el control de vector vacío, hay un aumento de la resistencia superior a 20 veces tanto a la pretomanida (CMI de 0,05 µM a >1 µM) como a la delamanida (CMI de 0,005 µM). µM a >0,1 µM). No se observó ningún cambio significativo en la inhibición entre la sobreexpresión de Mt-DprE1 y el vector vacío (MIC pretomanid, 0,1 μM; delamanid, 0,005 μM). Se realizaron estudios de control positivo y negativo utilizando BTZ (para apuntar específicamente a DprE1) e isoniazida, respectivamente. La resistencia a BTZ solo se observó con la cepa sobreexpresadora de DprE1, y no se observó ningún aumento en la resistencia contra la isoniazida con las cepas sobreexpresadoras de Mt-DprE1 o Mt-DprE2. Se utilizó una cepa sobreexpresadora de Mtb inhA para mostrar la especificidad de pretamonid y delamanid para la inhibición de DprE2 y no de otras enzimas ubicuas dependientes de NAD (P) H (Figura complementaria 1). La enumeración de UFC confirmó la interpretación de los resultados de MABA.

Las CIM de a pretomanid y b delamanid se establecieron utilizando cepas de M. bovis BCG que contienen los vectores de expresión constitutivos pMV261 (rojo), pMV261-Mt-dprE1 (azul) y pMV261-Mt-dprE2 (verde). c Se utilizó BTZ como control positivo para la inhibición de DprE1; Se utilizó d isoniazida como control negativo para la inhibición de DprE1 y DprE2. La viabilidad celular se determinó mediante la enumeración MABA y CFU. Las flechas en los gráficos MABA indican la concentración del fármaco seleccionado para la enumeración de UFC. Los datos se trazaron y ajustaron utilizando Prism GraphPad que muestra el porcentaje de supervivencia (MABA) o UFC/mL (puntos de datos individuales mostrados como círculos grises), según la media de datos triplicados (n = 3) de experimentos independientes con barras que representan el error estándar. . Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para confirmar la inhibición específica de la síntesis de DPA por pretomanid activado, se utilizó un ensayo in vitro con análisis de cromatografía en capa fina (TLC) para analizar la epimerización dependiente de DprE1-DprE2 de [14C]-DPR (decaprenilfosforil-D-ribosa) a [ 14C]-DPA (decaprenilfosforil-D-arabinosa) (Fig. 1) usando enzimas recombinantes (ya sea Mt-DprE1 o el complejo Mt-DprE1-DprE2). Delamanid se omitió de los ensayos cinéticos in vitro debido a su insolubilidad en los tampones utilizados. La Figura 3 muestra la oxidación enzimática Mt-DprE1 de [14C]-DPR (carril 1) a [14C]-DPX (decaprenilfosforil-2-cetoribosa) (carril 2). Este intermediario es bastante inestable y migra como una banda difusa. Cuando se acopla directamente con Mt-DprE2, [14C]-DPX se reduce in situ a [14C]-DPA (carril 3). Se observó una inhibición dependiente de la dosis de la síntesis de [14C] -DPA con concentraciones crecientes de pretomanid activado por Ddn (0-200 μM; carriles 4-7). En presencia de pretomanida 200 μM (no activada por Ddn), no se observó inhibición de la síntesis de [14C]-DPA (carril 8). Estos resultados significan que la pretomanida activada por Ddn inhibe la epimerización de DPR dependiente de Mt-DprE1-DprE2. Esto se corrobora aún más con el análisis de extractos de pared celular de micobacterias (arabinogalactano) después del marcaje con [14C] y el tratamiento con pretomanid, delamanid o BTZ: la abundancia relativa de arabinosa en comparación con galactosa disminuye al aumentar las concentraciones del fármaco (Figura complementaria 2). , lo que sugiere que la síntesis de DPA se ha visto afectada negativamente. Curiosamente, la inhibición de la epimerización de DPR por pretomanid activado por Ddn no causó una acumulación discernible de DPX, lo que sería concomitante con la inhibición de Mt-DprE2 solo. La ausencia de DPX podría proporcionar información sobre el mecanismo de inhibición y se investigó más a fondo mediante análisis cinético espectrofotométrico de la actividad de Mt-DprE1 y Mt-DprE2.

La epimerización in vitro dependiente de Mt-DprE1-DprE2 de [14C]-DPR a [14C]-DPA y la inhibición dependiente de la dosis por pretomanid activado por Ddn se analizó mediante autorradiografía TLC (2000 cpm; desarrollado en CHCl3:CH3OH:NH4OH: H2O (65:25:0,5:3,6, (v/v)); expuesto a película Kodak X-Omat durante 14 días). Se resumen los componentes de reacción de cada carril. El profármaco pretomanid se activó durante la noche a temperatura ambiente en presencia de Mt-DprE1/Mt-DprE1-DprE2, NADPH 200 μM y componentes activadores (más/menos Ddn). DPR, decaprenilfosforil-D-ribosa; DPX, decaprenilfosforil-2-cetoribosa; DPA, decaprenilfosforil-D-arabinosa. Los datos de origen de 3 TLC se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para confirmar aún más a DprE2 como el objetivo de la pretomanida activada por Ddn, así como para comprender mejor el mecanismo de inhibición, se utilizaron ensayos in vitro para analizar la actividad de Mt-DprE1 y Mt-DprE2. Ambos ensayos utilizan el análogo soluble de DPR, geranilgeranilfosforil-D-ribosa (GGPR), donde DprE1 convierte GGPR en el sustrato DprE2, geranilgeranilfosforil-2-cetoribosa (GGPX); Por tanto, la actividad DprE1 es un requisito previo para la actividad DprE2. El ensayo espectrofotométrico para la actividad DprE1 mide la reducción de resazurina, por el cofactor DprE1 FADH2, a resorufina fluorescente (excitación a 530 nm, emisión a 590 nm)26, mientras que el ensayo DprE2 sigue la oxidación del cofactor DprE2 NADPH (excitación a 340 nm, emisión a 445 nm)25 (Fig. 4a).

a Representación esquemática de los ensayos DprE1 y DprE2. La actividad de DprE1 se midió mediante un ensayo de fluorescencia que midió la reducción de resazurina a resorufina fluorescente cuando DprE1 oxidó GGPR al cetointermedio GGPX, utilizando el cofactor FAD. La actividad de DprE2 se controló mediante un cambio en la fluorescencia debido a la oxidación del cofactor DprE2, NADPH, a medida que el intermedio GGPX se reducía al producto GGPR. GGPR, geranilgeranilfosforil-D-ribosa; GGPX, geranilgeranilfosforil-2-cetoribosa; GGPA, geranilgeranilfosforil-D-arabinosa. b (i) Se requiere NAD(H) para la activación de pretomanida. La actividad de DprE2 se analizó tras la activación de pretomanid durante 3 h a 30 °C en presencia de diferentes combinaciones del complejo Mt-DprE1-DprE2 y los cofactores NADH, NADPH, NAD+ y NADP+. Los controles (mezclas de reacción menos GGPR) se restaron para eliminar la oxidación de NADPH de fondo. Las reacciones se realizaron por triplicado (n = 3) (los puntos de datos individuales de las réplicas se muestran como círculos grises) y las velocidades iniciales medias (μM NADPH oxidado/min) con el error estándar se representaron utilizando Prism GraphPad. b (ii) Medición de la estabilidad del complejo enzima-inhibidor mediante diálisis. Datos sin procesar que muestran la actividad DprE2 (midiendo la oxidación de NADPH) de Mt-DprE2 inhibido y desinhibido con pretomanida, antes y después de la diálisis. Los ensayos de actividad se realizaron por triplicado (n = 3), y se muestra un único conjunto de datos representativo. El control (naranja; menos Ddn y GGPR) muestra oxidación espontánea de NADPH. c Ensayo DprE2 que monitorea la actividad de DprE2 en el complejo Mt-DprE1-DprE2, d Ensayo DprE1 que monitorea la actividad de DprE1 en (i) el complejo Mt-DprE1-DprE2 y (ii) Mt-DprE1 solo, en presencia de concentraciones crecientes de Ddn activado y pretomanid no activado (activado durante 1,5 h a 30 °C antes de agregarlo a Mt-DprE1-DprE2/Mt-DprE1). Los ensayos en cyd se realizaron por triplicado (n = 3) y se trazaron gráficos con [inhibidor] (escala log10 μM) frente a la respuesta y se calculó la IC50 (concentración inhibidora media máxima) ajustando una curva dosis-respuesta de cuatro parámetros, utilizando Prism. Panel gráfico. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. Mt-DprE1-E2, complejo Mt-DprE1-DprE2.

Para investigar los requisitos para la activación de pretomanid, se incubaron diferentes combinaciones de los cofactores naturales sugeridos de DprE2, NADH y NADPH16, junto con las formas oxidadas, NAD+ y NADP+ (Fig. 4bi), con el profármaco en presencia y ausencia del complejo Mt-DprE1-DprE2 durante la activación con Ddn. El análisis posterior de la actividad de DprE2 mostró que, en ausencia de Mt-DprE1-DprE2 durante la activación, se requería NADH o NAD+ para convertir la pretomanida en una forma activa que pudiera inhibir la actividad de DprE2. Ni NADPH ni NADP+ mostraron esta capacidad. Sin embargo, si Mt-DprE1-DprE2 estaba presente durante la activación de Ddn, no era necesaria la adición de un cofactor de nicotinamida para que la pretomanida inhibiera la actividad de DprE2. Esto también se demostró con los ensayos de epimerización de DPR radiactivo, donde no se incluyó NAD(H). Esto nos llevó a concluir que el metabolito activo de la pretomanida no tiene una vida corta como se pensaba anteriormente8, sino que se metaboliza a componentes inactivos en ausencia de NAD(H). El requerimiento de Mt-DprE1-DprE2 durante la formación de un metabolito activo, en ausencia de NAD(H) adicional, sugiere que el complejo proporciona una fuente endógena del cofactor y que, por lo tanto, NADH es el cofactor natural de DprE2. Cabe señalar que continuamos monitoreando la oxidación de NADPH para detectar la actividad de DprE2, ya que se descubrió que Fgd1 oxida NADH en nuestro ensayo (Figura complementaria 3).

Para evaluar la estabilidad del complejo enzima-inhibidor, se dializó el complejo Mt-DprE1-DprE2 inhibido (3 h de incubación durante la activación de la pretomanida) durante la noche para diluir las moléculas inhibidoras no unidas y sus derivados. La actividad DprE2 (monitoreo de la oxidación de NADPH) del complejo Mt-DprE1-DprE2 inhibido (más Ddn) se comparó antes y después de la diálisis con el complejo Mt-DprE1-DprE2 no inhibido (menos Ddn). No hubo ningún efecto discernible de la diálisis sobre la actividad del complejo Mt-DprE1-DprE2 inhibido o no inhibido (Fig. 4bii); el complejo inhibido todavía estaba inhibido después de la diálisis con una curva similar a la del control negativo (sólo oxidación espontánea de NADPH) y el complejo no inhibido mostró una actividad comparable a la muestra predializada. La incapacidad de la DprE2 inhibida para recuperar su actividad después de la diálisis sugiere una inhibición irreversible, por la cual el inhibidor se ha unido de manera extremadamente fuerte o la composición química o la estructura terciaria de la enzima se ha alterado permanentemente.

Una vez establecidos los parámetros de activación del profármaco, se investigó la cinética de inhibición de las pretomanidas activadas. El ensayo DprE2 se utilizó para analizar la actividad de DprE2 como parte del complejo Mt-DprE1-DprE2; No pudimos purificar DprE2 activo en ausencia de DprE1, y la actividad de DprE1 es un requisito previo para la actividad de DprE2. El ensayo DprE1 se utilizó para determinar cualquier impacto del inhibidor activado en el paso principal de la epimerización de GGPR. En ambos ensayos, se incubaron concentraciones crecientes de pretomanida (0-50 μM) durante 1,5 h a 30 °C con el NAD+ y todos los componentes necesarios para la activación del profármaco. También se prepararon reacciones equivalentes, omitiendo Ddn, evitando la conversión del profármaco en una molécula activa. En presencia del profármaco pretomanid (no activado), la actividad de Mt-DprE2 fue evidente. Mientras que tras la activación de la pretomanida por Ddn, hubo una reducción dependiente de la dosis en la actividad de Mt-DprE2, con un valor calculado de concentración inhibidora media máxima (CI50) de 8,3 ± 0,2 μM (Fig. 4c; datos sin procesar, Fig. 4a complementaria). ) (± EEM). A continuación, se utilizó la reducción de resazurina catalizada por DprE1 para evaluar la inhibición de la pretomanida activada de la actividad de DprE1 en el complejo Mt-DprE1-DprE2, junto con cualquier inhibición de Mt-DprE1 solo (Fig. 4d; datos sin procesar, Fig. 4b y c complementarias). ). No hubo inhibición de la actividad de DprE1 ni con Mt-DprE1 solo ni con el complejo Mt-DprE1-DprE2. Esto se correlaciona con los datos de sobreexpresión, por lo que el aumento de los niveles celulares de DprE1 no tuvo ningún efecto sobre la MIC de pretomanid. El inhibidor de DprE1, BTZ (Fig. 5 complementaria), demostró la inhibición del ensayo de DprE1 tanto para Mt-DprE1 como para Mt-DprE1-DprE2 (valores de IC50 de 11,8 ± 0,7 μM y 24,0 ± 1,2 μM, respectivamente) (± SEM).

Para obviar el efecto de la concentración del sustrato y estudiar el modo de inhibición de DprE2 por pretomanid, se determinó la Ki (constante del inhibidor) variando la concentración de GGPR y NADPH en dos ensayos separados (Fig. 5). Las curvas se ajustaron con Prism GraphPad utilizando el modelo de regresión no lineal para la inhibición no competitiva para GGPR y la inhibición competitiva para NADPH, los cuales dieron el mejor ajuste, correlacionándose con sus correspondientes gráficos recíprocos dobles. Se calculó que el Ki era 4,9 ± 1,0 μM y 1,5 ± 0,4 μM para GGPR (alfa Ki) y NADPH respectivamente (± SEM).

La inhibición de pretomanid se realizó con una titulación del inhibidor y los dos sustratos, a GGPR y b NADPH. Se incubaron concentraciones crecientes de pretomanid durante 1,5 h a 30 °C, con NAD+ y los otros componentes activadores, y 100 μM o una titulación de NADPH. El complejo Mt-DprE1-DprE2 se incubó con la pretomanida activada durante 10 minutos y se midió la actividad de DprE2 después de la adición de 200 μM o una titulación de GGPR. Los ensayos se realizaron por triplicado (n = 3) y las tasas iniciales medias (μM NADPH oxidado/min), con el error estándar, se representaron usando Prism GraphPad, ajustando la curva usando el modelo de inhibición no competitiva (GGPR) e inhibición competitiva (NADPH). ). (i) La curva ajustada y (ii) la gráfica recíproca doble. Se restó la oxidación de NADPH de fondo. GGPR, geranilgeranilfosforil-D-ribosa; Ki, constante inhibidora. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Nuestros intentos iniciales para estos ensayos, mediante los cuales se incubó Mt-DprE1 o Mt-DprE1-DprE2 con pretomanida durante la activación durante 3 h (Figura complementaria 6), mostraron que, además de la inhibición del ensayo de DprE2, se produjo una reducción en la actividad de DprE1. También se observó para el complejo Mt-DprE1-DprE2 (IC50 de 25 ± 6,2 μM) (± SEM), aunque no para Mt-DprE1 solo. También hubo una diferencia en las curvas de Ki y los gráficos recíprocos, que se ajustaron para la inhibición no competitiva, con valores de Ki calculados de 16,4 ± 1,9 μM y 14,1 ± 1,9 μM, para GGPR y NADPH respectivamente (± SEM). Estos valores más altos probablemente representen una deficiencia de NAD+ requerido para la activación de pretomanid, lo que requiere ensayos adicionales.

Hemos confirmado que DprE2 es un objetivo de dos nuevos fármacos para Mtb clínicamente relevantes, delamanid y pretomanid, utilizando estudios de participación de objetivos de células completas y ensayos de actividad enzimática in vitro. La identificación del objetivo ha sido problemática para estos fármacos, ya que las exploraciones espontáneas de mutantes resistentes apuntan a la vía de activación de Ddn y no al verdadero objetivo10,11,12. Sólo cuando los inhibidores conocidos de DprE2 generaron perfiles de resistencia similares, se hizo realidad la posibilidad de que todos estos compuestos compartieran un objetivo común25. DprE2, junto con DprE1, forman un complejo de epimerasa esencial en la vía de síntesis de DPA, un donante de arabinosa ligado a lípidos para el componente crucial de la pared celular de Mtb, el arabinogalactano18,19,20,21. Estudios anteriores que demostraron ácidos micólicos reducidos en células tratadas con fármacos6,7, de hecho estaban cerca del objetivo, ya que una reducción en el contenido de arabinosa del dominio arabinogalactano probablemente disminuye los sitios de unión del ácido micólico. Una validación adicional de DprE2 como objetivo la proporcionan estudios metabolómicos, que informaron un aumento en los niveles de ribosa-5-fosfato en células tratadas con pretomanida27. La ribosa-5-fosfato es un precursor en la vía de síntesis de DPA y, en teoría, podría acumularse si se bloqueara la vía descendente.

La inhibición de pretomanid se demostró mediante los ensayos espectrofotométricos de DprE2 y los ensayos radiomarcados. Aunque aquí se informaron los valores de IC50 y Ki, la activación compleja del profármaco pretomanido por Ddn en varias especies diferentes significa que la concentración real del fármaco activo no es absoluta. Si bien no hubo ningún efecto sobre la actividad de DprE1 ni para Mt-DprE1 ni para el complejo Mt-DprE1-DprE2 cuando se añadió pretomanida preactivada antes del ensayo, el complejo Mt-DprE1-DprE2 se inhibió a un tercio de la actividad normal durante ensayos que incubaron el complejo durante 3 h durante la activación de pretomanid. El método de activación de pretomanid también fue significativo en el modo de inhibición observado calculado para los ensayos de Ki. Después de un breve tiempo de incubación con el pretomanido activado, los ensayos de DprE2 demostraron que el fármaco activo competía con el NADPH por el sitio activo, mientras que el fármaco mostraba una inhibición no competitiva con GGPR. Después de un tiempo de incubación más largo durante la activación de pretomanid, la inhibición no fue competitiva para ambos sustratos. Este cambio en la inhibición podría indicar un cambio lento en el modo de unión de la pretomanida activada desde una unión débil inicial a una unión más fuerte, una característica observada para el inhibidor de InhA isoniazida, que se propone unirse firmemente una vez que se ha formado el complejo inhibido final28. De hecho, se descubrió que el complejo enzima-inhibidor formado entre la pretomanida activada y DprE2 durante una larga incubación era muy estable y resistía un largo período de diálisis que serviría para diluir un compuesto débilmente unido. Una pretomanida más estrechamente unida también podría explicar la inhibición de la actividad de DprE1 observada después de una larga incubación con pretomanida. El inhibidor estrechamente unido podría prevenir la transferencia de sustrato de DprE1 a DprE2, bloqueando así la actividad de Mt-DprE1, una teoría respaldada por la ausencia de acumulación de DPX en nuestros estudios de epimerización de DPR.

Nos hemos esforzado por establecer el metabolito activo de pretomanid y delamanid y, aunque aún no lo hemos confirmado mediante espectrometría de masas, nuestros resultados sugieren fuertemente que se trata del aducto NAD descubierto previamente9,16. Este no sería el primer caso de tal aducto, que se ha informado para isoniazida y etionamida durante la inhibición de InhA28,29,30,31. Dado que DprE2 puede utilizar NADH/NADPH como cofactores, un aducto NAD-pretomanida explicaría la unión competitiva inicial observada para NADPH y también el requisito de DprE2 cuando no está presente NAD(H), lo que proporciona una fuente de NAD(H) para el aducto. formación durante la activación. Este hallazgo también implica que NADH es el cofactor natural para DprE2, ya que aquí se confirma que NADPH no puede formar un aducto inhibidor con pretomanid9, solo un suministro endógeno de NAD(H) de la enzima puede formar la especie activa. La separación de la activación pretomanida y la inhibición de DprE2 también indica que la forma activa no es tan efímera como se pensaba inicialmente8. El análisis estructural de los profármacos pretomanid y delamanid, junto con nuestros inhibidores de DprE2 recientemente descubiertos, muestran que comparten un grupo nitro común (resaltado en la Fig. 1a) unido a un anillo aromático. Sospechamos que es esta fracción la que Ddn reduce durante la activación del fármaco, como se sugirió anteriormente9. La posibilidad alternativa, que la pretomanida se reduzca a un derivado nitroso de vida corta que reaccione directamente con la enzima, como se observa para la inhibición de DprE125 por BTZ, parece menos probable con los resultados presentados aquí. Aunque tampoco podemos descartar que la multitud de otros metabolitos formados por la activación Ddn de pretomanid y delamanid podrían ser parte del mecanismo de muerte multifacético. Todas estas posibilidades están sujetas a futuras investigaciones.

A pesar de un esfuerzo concertado en el área, la pretomanida y la delamanida son algunos de los primeros medicamentos nuevos autorizados en más de 40 años, específicamente para pacientes con cepas MDR y XDR de Mtb, aquellas resistentes a los medicamentos actuales de primera y segunda línea. El descubrimiento de que un objetivo de estos dos nuevos antibióticos es DprE2 demuestra una vez más la magnitud de la farmacobilidad del complejo DprE1-DprE2. Prevemos que este hallazgo, junto con la evidencia acumulada del aducto NAD como fracción activa, acelerará los esfuerzos de descubrimiento de estos profármacos clínicamente prometedores, lo que ayudará a futuras exploraciones en el desarrollo de nuevos derivados de pretomanid y delamanid clínicamente exitosos.

Todos los datos recopilados del lector de placas POLARstar Omega (BMG Labtech) se analizaron en Microsoft Excel 16.66.1 y GraphPad Prism 9.5.1.

La cepa Pasteur de M. bovis BCG se cultivó en medio líquido estático (Middlebrook 7H9 (Difco), 10% (v/v) Middlebrook ADC, 0,25% (v/v) glicerol, 0,05% (v/v) Tween-80) a 37°C, 5% CO2. Los medios se complementaron con 25 μg/ml de kanamicina para seleccionar plásmidos micobacterianos.

Para estudios de sobreexpresión, se electroporaron micobacterias con construcciones de expresión micobacterianas. Brevemente, se prepararon micobacterias electrocompetentes granulando y lavando un cultivo de micobacterias a mitad de registro con volúmenes decrecientes de glicerol al 10% (v/v) a temperatura ambiente. Las células se transfirieron a una cubeta de electroporación con espacio entre electrodos de 0,1 cm, se incubaron con 1 μg de ADN plasmídico a 37 °C durante 10 minutos, antes de aplicar un único pulso de 1,8 kV. Las células se recuperaron durante la noche en medio líquido antes de la selección en medio sólido que contenía 25 μg/ml de kanamicina.

El vector de expresión micobacteriano pMV261-Mt-dprE1 se construyó utilizando los cebadores (sentido CTAGCTAGGGATCCAATGTTGAGCGTGGGAGCTAC, BamHI; antisentido CTAGCTAGAAGCTTCTACAGCAGCTCCAAGCGTCG, HindIII)26, pMV261-Mt-dprE2 se construyó con los cebadores (sentido CTAGCTAGGGATCCAATGGTTCTTGATGC CGTAGG, BamHI; antisentido CTAGCTAGAAGCTTTCAGATGGGCAGCTTGCGGAAG, HindIII)25 y Se construyó pMV261-Mt-inhA con los cebadores (sentido GATCGATCGGATCCAATGACAGGACTGCTGGACGG, BamHI; antisentido GATCGATCAAGCTTCTAGAGCAATTGGGTGTGCGC, HindIII). El vector de expresión de Escherichia coli pCDF-duet-Mt-dprE1 se construyó utilizando cebadores (sentido GATCGATCGGATCCGATGTTGAGCGTGGGAGCTACCACTACCG, BamHI; antisentido GATCGATCAAGCTTCTACAGCAGCTCCAAGCGTCGGGCCATG, HindIII)32 y el vector pCDF-duet-Mt-dprE1-dprE2 se produjo clonando adicionalmente el gen en codificación mt- DprE2 usando los cebadores (sentido CATGCATGCATATGGTCCTGGATGCTGTGGGC, NdeI; antisentido CATGCATGCTCGAGTCAAATCGGCAGTTTACGG, XhoI)25. El gen que codifica Mt-Ddn se clonó en las construcciones de expresión de micobacterias y Escherichia coli pVV16 (cebador sentido, GATCGATCCATATGCCGAAATCACCGCCGCGGTTTC, NdeI; cebador antisentido, GATCGATCAAGCTTGGGTTCGCAAACCACGATCGGG, HindIII) y pET28SUMO (cebador sentido, GATCGATCGGATCCATGCCGAAATCACCGCCGCGGTTTC, BamHI; cebador antisentido, GATCGATCAAGCTTTCAGGGTTCGCAAAACCACGATCGGG, HindIII), respectivamente. El gen que codifica Mt-Fgd1 se clonó en la construcción de expresión de E. coli pET28a (cebador sentido, GATCGATCCATATGGCTGAACTGAAGCTAGGTTACAAAGC, NdeI; cebador antisentido, GATCGATCAAAGCTTTCAGCCAAGTCGCCGCAACC, HindIII). De acuerdo con las instrucciones del fabricante (Q5 High Fidelity DNA Polymerase, New England Biolabs), los genes se amplificaron mediante PCR a partir del ADN genómico de Mtb H37Rv, se purificaron (QIAquick PCR Purification Kit, Qiagen) y los productos y vectores de la PCR se digirieron con las enzimas de restricción especificadas. (FastDigest, Thermo Fisher Scientific). Los productos de la digestión se purificaron, se ligaron (ADN ligasa T4, New England Biolabs) y se transformaron en células TOP10 de E. coli. Se seleccionaron clones positivos de medio sólido (agar LB con 50 μg/ml de kanamicina) y las construcciones se verificaron mediante secuenciación de ADN (Source Bioscience).

Las proteínas recombinantes SUMO-Ddn y Fgd1 se sobreexpresaron en células E. coli BL21 (DE3) (de pET28SUMO y pET28a respectivamente). Las células se cultivaron en caldo Terrific a 37 ° C, con agitación, hasta una DO600 nm de 0,4 a 0,6. La producción de proteínas recombinantes se indujo con isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM y las células se cultivaron durante la noche a 16 °C y posteriormente se recogieron.

Las proteínas recombinantes se purificaron mediante la explotación de la etiqueta His codificada por el vector. Los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón de unión (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, NaCl 0,5 M, imidazol 25 mM) y se rompieron mediante sonicación. El material insoluble se eliminó mediante centrifugación a 40 000 xg, 4 °C, y el lisado clarificado se aplicó a una columna de cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) cargada de níquel (HisTrap IMAC HP, GE Healthcare) preequilibrada en tampón de unión. La columna se lavó y la proteína recombinante eluyó usando un gradiente escalonado de imidazol en tampón de unión (25, 50, 100, 150, 200, 1000 mM). Las fracciones que contenían proteínas recombinantes purificadas se dializaron en Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, glicerol al 10%. Para eliminar la etiqueta de solubilidad SUMO marcada con His de Ddn, se incluyó proteasa SUMO con el SUMO-Ddn recombinante purificado durante la diálisis. Se repitió IMAC con tampón de unión y un gradiente escalonado de imidazol (0, 10, 25, 50, 100, 300, 1000 mM) para separar Ddn de SUMO-Ddn y la proteasa SUMO marcada con His. Las fracciones que contenían Ddn purificado se dializaron en Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, glicerol al 10%. Los Ddn y Fgd1 recombinantes se concentraron y almacenaron a -20 °C.

Mt-DprE1 solo y el complejo Mt-DprE1-DprE2 se expresaron a partir del vector pCDF-duet en células E. coli BL21 (DE3), junto con las chaperonas del plásmido pTrc-60.2-groES25,32,33. Las células se cultivaron a 37 °C, con agitación, hasta la fase logarítmica media en caldo excelente (Difco), se complementó con espectinomicina (100 µg/ml) y ampicilina (100 µg/ml) y luego se enfriaron a 20 °C en un baño de hielo. La expresión se indujo durante la noche a 20 °C con IPTG 0,5 mM, antes de sedimentar las células. Los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón de lisis (Tris-HCL 50 mM (pH 8), NaCl 50 mM y glicerol al 10%), se sonicaron en hielo, el material insoluble se sedimentó a 75.000 xg, 4 °C y el material soluble se pasó a través de un Su columna Trap. Las proteínas se lavaron en tampón de lisis con imidazol 20 mM y eluyeron con imidazol 300 mM. Se realizó una etapa de purificación adicional con una columna QHP en tampón de lisis con concentraciones crecientes de NaCl. El complejo Mt-DprE1-DprE2 pasa directamente a través de la columna, mientras que Mt-DprE1 solo eluye con NaCl 120-140 mM. Las proteínas se dializaron en tampón de lisis con NaCl 200 mM, se concentraron y se almacenaron a -80 °C.

La CIM líquida de cepas sobreexpresadoras de micobacterias (M. bovis BCG que alberga las construcciones de expresión pMV261, pMV261-Mt-dprE1, pMV261-Mt-dprE2 y pMV261-Mt-inhA) con diferentes compuestos se evaluó utilizando el ensayo de azul alamar en microplaca ( MABA). Brevemente, las células de registro medio (OD600 nm 0,4–0,8) se diluyeron a 1 × 106 unidades formadoras de colonias (UFC)/ml (OD600 nm de 1, equivale a 2,5 × 108 UFC/ml) en el medio de crecimiento líquido especificado. Se agregaron 99 μl de células a pocillos individuales de una placa de 96 pocillos (paredes negras, negro, fondo plano; Greiner) junto con 1 μl 100 × la concentración deseada del compuesto (concentraciones crecientes en toda la placa). Todos los compuestos se disolvieron en DMSO al 100%, a excepción de la isoniazida, que se disolvió en agua. Las placas se incubaron a 37 °C, 5% de CO2 durante 7 días. Se agregaron 30 µl de resazurina al 0,02 % (p/v) y 12,5 µl de Tween 80 al 20 % a cada pocillo y las placas se incubaron durante 24 h más. La viabilidad celular se estableció midiendo la fluorescencia (λ excitación 530 nm, λ emisión 590 nm) utilizando un lector de placas POLARstar Omega. Los datos se ajustaron mediante regresión no lineal (Prism, GraphPad).

M. bovis BCG de registro medio (OD600 nm 0,4–0,8) que alberga las construcciones de expresión pMV261, pMV261-Mt-dprE1 o pMV261-Mt-dprE2 se diluyeron a 1 × 106 unidades formadoras de colonias (UFC)/ml. En una placa de 96 pocillos, se trataron 99 µl de células por triplicado con la concentración de fármaco deseada de pretomanid, delamanid, BTZ o INH y se incubaron a 37 °C, 5 % de CO2 durante 7 días. Las células se resuspendieron y se dirigieron 5 µl de cada suspensión a agar 7H11 que contenía 25 µg/ml de kanamicina. Se diluyeron en serie otros 5 μl de 10-1 a 10-6. Antes de detectar medios sólidos. Las placas de agar se incubaron durante 2 semanas a 37 °C antes de contar las UFC.

El efecto de pretomanid y delamanid sobre la biosíntesis de arabinogalactano de células completas se evaluó mediante marcaje con [14C]. El estudio se realizó con Mycobacterium smegmatis mc2155 debido a la incapacidad de M. bovis BCG para captar el radiomarcador requerido ([14C]-glucosa). M. smegmatis de tipo salvaje es inherentemente resistente a pretomanid y delamanid, por lo que en los experimentos de etiquetado se utilizó M. smegmatis que alberga la construcción de expresión micobacteriana pVV16-ddn: la sobreexpresión constitutiva de Ddn permitió la activación del profármaco, reduciendo las CIM de delamanid de >10 μM a 0,5 μM y pretomanida de >200 μM a 2,5 μM.

La cepa mc2155 de M. smegmatis se cultivó en caldo Luria-Burtani (LB) líquido estático o en agitación con medio Tween-80 o sales de glicerol-alanina (GAS) al 0,05 % (v/v) (Bacto casitona, citrato férrico de amonio 100 μM, K2HPO4 23 mM, ácido cítrico 10 mM, L-alanina 11 mM, MgCl2-6H2O 6 mM, K2SO4 3 mM, NH4Cl 37 mM, glicerol al 1 % (v/v), pH 6,6) con Tween al 0,05 % (v/v) -80 a 37°C. Para el crecimiento en medio sólido se utilizó agar LB. Los medios se complementaron con 25 μg/ml de kanamicina para seleccionar el plásmido micobacteriano, pVV16-ddn.

La construcción de expresión micobacteriana pVV16-ddn se generó utilizando procedimientos de clonación estándar (cebador sentido, GATCGATCCATATGCCGAAATCACCGCCGCGGTTTC, NdeI; cebador antisentido, GATCGATCAAGCTTGGGTTCGCAAACCACGATCGGG, HindIII) y se electroporó en M. smegmatis.

M. smegmatis mc2155 que alberga el vector pVV16-ddn se cultivó hasta la mitad del registro (OD600 nm 0,4–0,8) y se diluyó hasta OD600 nm 0,2. Se trataron cultivos celulares de 10 ml con un aumento del fármaco dependiente de la dosis (0x, 0,5x y 1x MIC; MIC: delamanid, 0,5 μM; pretomanid, 2,5 μM; BTZ, 15 nM) durante 6 h antes de agregar 1 μCi/mL [14C ]-D-glucosa (PerkinElmer) durante 16 h más. Se recogieron las células y los sedimentos se lavaron en solución salina tamponada con fosfato. Las células se extrajeron 3 veces en 3 ml de cloroformo:metanol 2:1 a 50 °C durante 2 h. El sedimento se trató 3 veces con 1 ml de etanol al 50 % (v/v), 80 °C durante 1 h, seguido de 3 veces con 1 ml de SDS al 2 % (p/v), 90 °C durante 1 h. Luego se resuspendió el sedimento en 1 ml de acetona al 80 % (v/v), se descartó el disolvente y se resuspendió en 1 ml de acetona al 100 % (v/v). Se descartó el disolvente y luego se secó el sedimento. El sedimento de arabinogalactano se hidrolizó durante 3 h en 300 μl de ácido trifluoroacético 2 M a 120 °C. El ácido trifluoroacético se evaporó y los azúcares resultantes se analizaron mediante TLC (gel de sílice HPTLC con soporte de aluminio 60 F254) en acetona:agua 15:1 (v/v), usando recuentos iguales (50.000 cpm) y se expusieron a Kodak X. -Película Omat durante 5 días. Los azúcares se identificaron utilizando estándares fríos. La abundancia relativa de arabinosa y galactosa se determinó mediante densitometría.

La inhibición pretomanida de DprE2 en presencia de DprE1 se abordó mediante el seguimiento de la conversión de [14C]-DPR en [14C]-DPA. [14C]-DPR se preparó como anteriormente34: se resuspendieron 100 μCi (100 mCi/mmol) de [14C]-glucosa seca (PerkinElmer) en 800 μL de tampón (Hepes 50 mM, pH 7,6, MgCl2 2 mM y MnCl2 0,5 mM). añadiendo 10 unidades de hexoquinasa, ATP 2 mM, NADP 8 mM. Después de una incubación de 2 minutos a temperatura ambiente, se añadieron 10 unidades de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, 2 unidades de 6-fosfogluconato deshidrogenasa, 10 unidades de fosforriboisomerasa y 1 unidad de fosforribosilpirofosfato sintetasa y la mezcla se incubó a 37 °C durante 30 minutos. . Se añadió lentamente más ATP 3 mM durante una hora. El p[14C]Rpp resultante se filtró a través de un filtro centrífugo de 10 kDa de 1,5 ml (Amicon), para eliminar las enzimas, y se separó de los productos de reacción intermedios y los sustratos usando una columna LC-SAX SPE de 3 ml (Merck), lavando con agua. y eluyendo con un gradiente de acetato de sodio en agua (300 mM a 2 M). Las fracciones se visualizaron en una TLC de celulosa con soporte de vidrio, se separaron en tampón fosfato 0,85 M con pH alterado a 3,4 con ácido fosfórico y se expusieron a una película Kodak X-Omat durante 1 noche. 1 millón de cuentas de p[14C]Rpp se convirtieron en [14C]-DPR incubando con 100 μL de membranas de M. smegmatis inhibidas por BTZ (100 μM de BTZ en un total de 300 μL de tampón MOP 50 mM, pH 7,9, ATP 1 mM, preincubado durante 10 minutos a 37 °C) y 15 μL de fosfato de decaprenilo (C50-P) (1 mM en CHAP al 1%) durante 1,5 h a 37 °C. [14C]-DPR se separó añadiendo 3,7 ml de 10:10:3 (CHCl3: CH3OH: H2O) (v/v) e incubando a temperatura ambiente durante 8 h. Luego se agregaron 750 µL de H2O y 1,75 ml de CHCl3 para establecer una bifase, lavando la capa orgánica inferior dos veces con 3:47:48 (CHCl3: CH3OH: H2O) (v/v), secando la fracción orgánica inferior.

Se activaron concentraciones crecientes de pretomanida (0, 50, 100, 200 μM) durante la noche a temperatura ambiente en tampón (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM) con Fgd1 4 μM, F420 36 μM, glucosa-6-1 mM. fosfato, Ddn 5 µM, NADPH 300 µM, Mt-DprE1-DprE2 10 µM. También se prepararon reacciones de control: (carril 1) tampón de reacción; (carril 2) tampón de reacción con Mt-DprE1 10 µM, NADPH 300 µM; (carril 3) tampón de reacción con Mt-DprE1-DprE2 10 µM, NADPH 300 µM; (carril 8) pretomanida 200 µM en ausencia de Ddn. Las reacciones se iniciaron con 5 μL de GGPR y 5,5 μL de [14C]-DPR (2000 cpm) en IGEPAL al 1 % durante 1 h a 37 °C y luego se apagaron con 350 μL de CHCl3:CH3OH (2:1 (v/v). )). La capa inferior de la bifase se secó, se resuspendió en 10 µL de CHCl3:CH3OH (2:1) (v/v), se sembró sobre una TLC de sílice de alto rendimiento (Merck) y se separó mediante CHCl3:CH3OH:NH4OH:H2O (65 :25:0.5:3.6, (v/v)). Las bandas se visualizaron después de la exposición a la película Kodak X-Omat durante 2 semanas.

La pretomanida se activó durante 1,5 h a 30 °C en presencia de NAD+. Se agregaron los siguientes reactivos a un volumen final de 22 μL: tampón de reacción (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, MgCl2 4 mM, NaCl 100 mM), Fgd1 5 μM, F420 12 μM, glucosa-6-fosfato 1 mM y 200 µM NAD+. Se añadió 1 μL de pretomanid diluido en serie en DMSO con concentraciones crecientes en un formato de dosis-respuesta (0, 0,78, 1,56, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50 μM). Ddn 5 μM inició la activación del profármaco. Se prepararon reacciones de control equivalentes en ausencia de Ddn. Luego, el fármaco pretomanido activo se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente con Mt-DprE1 10 μM solo o con un complejo Mt-DprE1-DprE2 10 μM. A continuación, se añadió NADPH 100 μM y se realizaron los ensayos DprE126 y DprE225, dividiendo en alícuotas la mezcla de ensayo (23 μL) en placas Greiner 384 de fondo negro. Para el ensayo DprE1, se añadió resazurina 100 µM (stock 2 mM) a las reacciones antes de cargarlas en la placa. Las reacciones se midieron (ensayo DprE2: λ excitación 340 nm, λ emisión 445 nm; ensayo DprE1: λ excitación 530 nm, λ emisión 590 nm), 37 °C, utilizando un lector de placas POLARstar Omega (BMG Labtech). La reacción se inició mediante la adición de 200 μM de GGPR (stock 2,5 mM) utilizando una pipeta multicanal. Las reacciones se realizaron por triplicado.

Los ensayos para determinar el Ki con diferentes concentraciones de sustrato se realizaron como se indicó anteriormente, utilizando concentraciones crecientes de pretomanid (0, 5, 10, 25, 50, 75, 100 μM), incubando con 200 μM NAD+ durante 1,5 h a 30 °C, con las enzimas activadoras y sus constituyentes. Después de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente del pretomanido activo con el complejo Mt-DprE1-DprE2, se midió la actividad de DprE2 después de la adición de NADPH 100 μM y una titulación de GGPR (0, 25, 50, 75, 100, 150, 200 μM) o GGPR 200 μM y una titulación de NADPH (6,125, 12,5, 25, 50, 100, 200 μM) (λ excitación 340 nm, λ emisión 445 nm) a 37 °C, utilizando un POLARstar Omega (BMG Labtech) Lector de placas. Las reacciones se realizaron por triplicado.

Para el ensayo de requisitos de activación, se incubaron pretomanid 200 μM con las enzimas activadoras y los constituyentes durante 3 h a 30 °C, con NADH, NADPH, NAD+, NADP+ 100 μM o sin cofactor de nicotinamida, más/menos Mt-DprE1- 10 μM. Complejo DprE2 y más/menos Ddn 10 μM. Después de la activación de la pretomanida, se incubó el complejo Mt-DprE1-DprE2 10 μM durante 10 minutos a temperatura ambiente con los ensayos que carecían del complejo. Se agregaron 100 µM de NADPH a cada ensayo (excepto cuando ya estuviera presente) y se midió la actividad de DprE2 después de la adición de 200 µM de GGPR (stock 2,5 mM). Las reacciones se realizaron por triplicado.

Durante los ensayos iniciales, el requisito parecía ser DprE2 y no se sabía que NAD(H) fuera necesario. Por lo tanto, la pretomanida se activó en presencia del complejo Mt-DprE1-DprE2 (o Mt-DprE1 solo) durante 3 h a 30 °C en presencia de NADPH 100 μM y los otros componentes para la activación (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, MgCl2 4 mM, NaCl 100 mM), Fgd1 5 μM, Ddn 5 μM, F420 12 μM, 1 mM (glucosa-6-fosfato) en un volumen final de 22 μL. Los valores de IC50 se midieron añadiendo 1 μL de concentraciones crecientes de pretomanid. También se realizaron ensayos de Ki activando una titulación de pretomanida de esta manera, titulando NADPH durante el período de activación o GGPR para iniciar la reacción, manteniendo constante el otro sustrato. La actividad de DprE1 y DprE2 se midió con normalidad.

Para el experimento de diálisis, la mezcla de ensayo se aumentó a 1 ml manteniendo constantes las concentraciones de todos los componentes del ensayo. El complejo Mt-DprE1-DprE2 se inhibió con pretomanid 400 μM, más y menos el activador Ddn. Después de una incubación de 3 h a 30 °C, la mitad de cada ensayo se dializó durante la noche en fosfato de potasio 50 mM, KCl 500 mM, glicerol al 10 % a 4 °C, utilizando un tubo de diálisis de corte de 14 kDa (Sigma). La otra mitad de la mezcla se almacenó a 4ºC. Se midió la DO280 nm para cada muestra usando una nanogota y la concentración de las muestras previas a la diálisis se redujo usando el tampón de diálisis para tener en cuenta el efecto diluyente de la diálisis. Se cargaron 20 μl de las muestras, antes y después de la diálisis, en placas Greiner 384 de fondo negro, añadiendo a la muestra dializada NADPH 100 μM. La reacción se inició con 200 μM de GGPR (stock 1 mM) y se midió la actividad de DprE2 (λ excitación 340 nm, λ emisión 445 nm) a 37 °C, utilizando un lector de placas POLARstar Omega (BMG Labtech). Las reacciones se realizaron por triplicado.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos generados en este estudio (Fig. 2, recuentos de fluorescencia y UFC; Fig. 3, TLC sin recortar; Figs. 4 y 5, recuentos de fluorescencia; Figura complementaria 1, recuentos de fluorescencia y UFC; Figura complementaria 2, valores de densitometría; Las figuras complementarias 3, 4, 5 y 6, recuentos de fluorescencia) se proporcionan con este documento en el archivo de datos de origen. Los datos originales se proporcionan con este documento.

Chakaya, J. y col. Informe mundial sobre la tuberculosis 2020: reflexiones sobre la carga mundial de la tuberculosis, los esfuerzos de tratamiento y prevención de la tuberculosis. En t. J. Infectar. Dis. https://doi.org/10.1016/j.ijid.2021.02.107 (2021).

Organización Mundial de la Salud. Informe Mundial sobre la Tuberculosis 2022 (Prensa de la Organización Mundial de la Salud, Ginebra, 2022).

von Groote-Bidlingmaier, F. et al. Eficacia y seguridad de delamanid en combinación con un régimen de base optimizado para el tratamiento de la tuberculosis multirresistente: un ensayo de fase 3 multicéntrico, aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo y de grupos paralelos. Lanceta respira. Medicina. 7, 249–259 (2019).

Artículo de Google Scholar

Conradie, F. y col. Tratamiento de la tuberculosis pulmonar altamente resistente a los medicamentos. N. Ing. J. Med. 382, 893–902 (2020).

Artículo CAS Google Scholar

Hunt A. La FDA aprueba un nuevo fármaco para formas de tuberculosis resistentes al tratamiento que afectan los pulmones. https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-new-drug-treatment-resistent-forms-tuberculosis-affects-lungs (2019).

Matsumoto, M. y col. OPC-67683, un derivado de nitro-dihidro-imidazooxazol con acción prometedora contra la tuberculosis in vitro y en ratones. PLoS Med. 3, e466 (2006).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Stover, CK y cols. Un fármaco candidato a nitroimidazopirano de molécula pequeña para el tratamiento de la tuberculosis. Naturaleza 405, 962–966 (2000).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Singh, R. y otros. PA-824 mata Mycobacterium tuberculosis no replicante mediante la liberación intracelular de NO. Ciencia 322, 1392-1395 (2008).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hayashi, M. y col. Formación de aductos de delamanid con NAD en micobacterias. Antimicrobiano. Agentes Chemother. 64, e01755–19 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fujiwara, M., Kawasaki, M., Hariguchi, N., Liu, Y. y Matsumoto, M. Mecanismos de resistencia al delamanid, un fármaco para Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis 108, 186-194 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Haver, HL y cols. Las mutaciones en los genes de la vía biosintética F420 y de una enzima nitroreductasa son los principales determinantes de la resistencia en animales espontáneos seleccionados in vitro. Antimicrobiano. Agentes Chemother. 59, 5316–5323 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rifat, D. y col. Mutaciones en fbiD (Rv2983) como nuevo determinante de resistencia a pretomanid y delamanid en Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobiano. Agentes Chemother. 65, e01948–20 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Manjunatha, U., Boshoff, HI y Barry, CE El mecanismo de acción de PA-824: nuevos conocimientos a partir de perfiles transcripcionales. Comunitario. Integral Biol. 2, 215–218 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Boshoff, HI y Barry, CE ¿Es la pared celular micobacteriana un objetivo farmacológico desesperado para la tuberculosis latente? Descubrimiento de drogas. Hoy Dis. Mec. 3, 237–245 (2006).

Artículo de Google Scholar

Den Bossche, AV y cols. El perfil transcripcional de una cepa clínica y de laboratorio de Mycobacterium tuberculosis sugiere intoxicación respiratoria tras la exposición a delamanid. Tuberculosis 117, 18-23 (2019).

Artículo PubMed Google Scholar

Kreutzfeldt, KM et al. CinA media la tolerancia a múltiples fármacos en Mycobacterium tuberculosis. Nat. Comunitario. 13, 2203 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kolly, GS y cols. Evaluación de la esencialidad de la vía decaprenil-fosfo-d-arabinofuranosa en Mycobacterium tuberculosis utilizando mutantes condicionales. Mol. Microbiol. 92, 194-211 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Wolucka, BA Biosíntesis de D-arabinosa en micobacterias: una nueva vía bacteriana con implicaciones para la terapia antimicobacteriana. FEBS J. 275, 2691–2711 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Alderwick, LJ, Harrison, J., Lloyd, GS y Birch, HL La pared celular de micobacterias: peptidoglicano y arabinogalactano. Puerto de primavera fría. Perspectiva. Medicina. 5, 1-16 (2015).

Artículo CAS Google Scholar

Mikušová, K. et al. La decaprenilfosforil arabinofuranosa, el donante de los residuos D-arabinofuranosilo del arabinano micobacteriano, se forma mediante una epimerización en dos pasos de la decaprenilfosforil ribosa. J. Bacteriol. 187, 8020–8025 (2005).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Alderwick, LJ y cols. La eliminación de Cg-emb en corynebacterianeae conduce a un nuevo arabinogalactano de pared celular truncado, mientras que la inactivación de Cg-ubiA da como resultado un mutante deficiente en arabinano con un núcleo de galactano de pared celular. J. Biol. Química. 280, 32362–32371 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Makarov, V. y otros. Las benzotiazinonas matan a Mycobacterium tuberculosis bloqueando la síntesis de arabinano. Ciencia 324, 801–804 (2009).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pasca, MR et al. Los aislados clínicos de Mycobacterium tuberculosis en cuatro hospitales europeos son uniformemente susceptibles a las benzotiazinonas. Antimicrobiano. Agentes Chemother. 54, 1616-1618 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Organización Mundial de la Salud. Informe Mundial sobre la Tuberculosis 2019 (Prensa de la Organización Mundial de la Salud, Ginebra, 2019).

Batt, SM y cols. Desarrollo de ensayos e inhibición de la reductasa esencial Mt-DprE2 de Mycobacterium tuberculosis. Microbiología 169, 001288 (2022).

Google Académico

Batt, SM y cols. La participación del objetivo de células completas identifica nuevos inhibidores de la decaprenilfosforil-β-d-ribosa oxidasa de Mycobacterium tuberculosis. Infección por SCA. Dis. 1, 615–626 (2016).

Artículo de Google Scholar

Baptista, R., Fazakerley, DM, Beckmann, M., Baillie, L. & Mur, LAJ La metabolómica no dirigida revela un nuevo modo de acción de la pretomanida (PA-824). Ciencia. Reps. Rev. 8, 5084 (2018).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rawat, R., Whitty, A. & Tonge, PJ El aducto isoniazida-NAD es un inhibidor lento y de unión estrecha de InhA, la enoil reductasa de Mycobacterium tuberculosis: afinidad del aducto y resistencia a los medicamentos. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 100, 13881 (2003).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cade, CE, Dlouhy, AC, Medzihradszky, KF, Salas-Castillo, SP y Ghiladi, RA Mutaciones que confieren resistencia a la isoniazida en Mycobacterium tuberculosis KatG: actividades de formación de aductos de catalasa, peroxidasa y INH-NADH. Ciencia de las proteínas. 19, 458–474 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rozwarski, DA, Grant, GA, Barton, DHR, Jacobs, WR y Sacchettini, JC Modificación del NADH del objetivo de isoniazida (InhA) de Mycobacterium tuberculosis. Ciencia 279, 19-23.

Artículo de Google Scholar

Wang, F. y col. Mecanismo de acción del fármaco tioamida contra la tuberculosis y la lepra. J. Exp. Medicina. 204, 73–78 (2007).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Batt, SM y cols. Bases estructurales de la inhibición de Mycobacterium tuberculosis DprE1 por inhibidores de benzotiazinona. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 109, 11354–11359 (2012).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hu, Y. et al. Un mutante de Mycobacterium tuberculosis que carece del homólogo groEL cpn60.1 es viable pero no logra inducir una respuesta inflamatoria en modelos animales de infección. Infectar. Inmune. 76, 1535-1546 (2008).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Scherman, MS y cols. Las poliprenilfosfato-pentosas en micobacterias se sintetizan a partir de pirofosfato de 5-fosforribosa. J. Biol. Química. 271, 29652–29658 (1996).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Descargar referencias

Los autores agradecen a Albel Singh por fotografiar los TLC para las figuras. La financiación se ha otorgado de la siguiente manera: Cátedra de investigación personal del Sr. James Bardrick, GSB Medical Research Council MR/S000542/1, GSB Medical Research Council MR/R001154/1, GSB Sir Charles Hercus Health Research Fellowship otorgada a través del Health Research Council de Nueva Zelanda, GB

Estos autores contribuyeron igualmente: Katherine A. Abrahams, Sarah M. Batt.

Instituto de Microbiología e Infecciones, Facultad de Biociencias, Universidad de Birmingham, Edgbaston, Birmingham, B15 2TT, Reino Unido

Katherine A. Abrahams, Sarah M. Batt, Sudagar S. Gurcha, Natacha Veerapen y Gurdyal S. Besra

Laboratorio de Bioquímica Molecular y Microbiana, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Auckland, 3A Symonds Street, Auckland, 1010, Nueva Zelanda

Ghader Bashiri

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

Conceptualización: KAA, SMB, GSB Metodología: KAA, SMB, GSB Investigación: KAA, SMB, SS, NV, GB, GSB Visualización: KAA, SMB, GSB Supervisión: GSB Redacción—borrador original: KAA, SMB, GSB Redacción—revisión y edición: KAA, SMB, GSB

Correspondencia a Gurdyal S. Besra.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Junhao Zhu y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Abrahams, KA, Batt, SM, Gurcha, SS et al. DprE2 es un objetivo molecular de los compuestos antituberculosos de nitroimidazol pretomanid y delamanid. Nat Comuna 14, 3828 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39300-z

Descargar cita

Recibido: 25 de noviembre de 2022

Aceptado: 01 de junio de 2023

Publicado: 28 de junio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39300-z

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, actualmente no hay un enlace para compartir disponible para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenidos Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.