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Jul 15, 2023

catiónico

npj Vaccines volumen 8, Número de artículo: 106 (2023) Cita este artículo 389 Accesos 3 Detalles de Altmetric Metrics El virus sincitial respiratorio (VRS) es una de las principales causas de enfermedades del tracto respiratorio superior e inferior.

npj Vaccines volumen 8, Número de artículo: 106 (2023) Citar este artículo

389 Accesos

3 altmétrico

Detalles de métricas

El virus sincitial respiratorio (VRS) es una de las principales causas de infección del tracto respiratorio superior e inferior, especialmente en niños y ancianos. Se han probado varias vacunas que contienen las principales proteínas de superficie transmembrana del RSV (proteínas F y G); sin embargo, han brindado una protección inadecuada o están asociados con el riesgo de enfermedad potenciada por vacunas (EVE). Recientemente, la inmunización materna basada en proteína F y las vacunas para pacientes de edad avanzada han mostrado resultados prometedores en ensayos clínicos de fase III; sin embargo, estas vacunas se han administrado mediante inyección. Aquí, examinamos el potencial de utilizar el ectodominio de la proteína hidrofóbica pequeña (SHe), también una proteína de superficie transmembrana del VRS, como antígeno de vacuna nasal. Se formuló una vacuna utilizando nuestro nanogel catiónico de pululano que contiene un grupo colesterilo previamente desarrollado como sistema de administración, y SHe se vinculó por triplicado a la proteína A de la superficie del neumococo como proteína transportadora. La inmunización nasal de ratones y ratas algodoneras indujo anticuerpos IgG séricos específicos de SHe y anticuerpos IgA de las mucosas, previniendo la invasión viral tanto en el tracto respiratorio superior como en el inferior sin inducir VED. Además, la inmunización nasal indujo una mayor inmunidad protectora contra el RSV en el tracto respiratorio superior que la inmunización sistémica, lo que sugiere un papel crítico para las respuestas de IgA específicas del RSV en la mucosa en la eliminación viral en el epitelio de las vías respiratorias. Por lo tanto, nuestra vacuna nasal indujo una protección eficaz contra la infección por VRS en la mucosa de las vías respiratorias y, por lo tanto, es una vacuna candidata prometedora para un mayor desarrollo.

El virus sincitial respiratorio (VRS) es una de las principales causas de infección del tracto respiratorio superior e inferior, especialmente en niños menores de cinco años1 y ancianos2. La bronquiolitis y la neumonía por VSR en la infancia favorecen el desarrollo de asma y alergia3. Los niños de alto riesgo (p. ej., aquellos con cardiopatía congénita o inmunodeficiencia) a menudo desarrollan complicaciones graves, a veces letales, debido a la infección por el VRS4,5, y lo mismo se aplica a los adultos de alto riesgo6. Actualmente, el único agente terapéutico disponible contra el VRS La infección es un anticuerpo monoclonal IgG1 humanizado dirigido a la glicoproteína de fusión (F) del VRS y solo está aprobado para su uso en niños de alto riesgo7,8. También es una inmunización pasiva y costosa que requiere repetidas inyecciones intramusculares mensuales, lo que supone una carga económica, física y psicológica para los pacientes, sus familias y los sistemas de atención sanitaria9,10. Por tanto, se necesita urgentemente una estrategia de inmunización activa, una vacuna profiláctica contra el VRS.

En la década de 1960, se llevaron a cabo ensayos clínicos de una vacuna contra el VRS inactivada con formalina (FI) que inducía anticuerpos neutralizantes; sin embargo, la vacuna no proporcionó protección suficiente, lo que dejó a los bebés inmunizados vulnerables a complicaciones clínicas graves, a veces letales, después de la infección natural por VRS, una afección conocida como enfermedad potenciada por la vacuna (EVE)11,12. Desde entonces, se han investigado muchas vacunas experimentales utilizando subunidades de dos de las principales glicoproteínas de superficie del VRS, la proteína F13,14 y la glicoproteína de unión (proteína G)13,15, o el VRS vivo atenuado16,17,18 como antígenos candidatos. Recientemente, se han desarrollado varias vacunas candidatas prometedoras que actualmente se encuentran bajo investigación clínica19, con resultados particularmente alentadores provenientes de los ensayos de fase III de vacunas basadas en proteína F20,21,22. Sin embargo, la vacuna inyectable es generalmente menos efectiva para la inducción de inmunidad protectora en el sitio de invasión del RSV de la superficie mucosa de las vías respiratorias, mientras que se ha demostrado que la vacuna nasal induce respuestas inmunes tanto mucosas como sistémicas contra patógenos respiratorios23,24,25,26. 27.

Además de las principales glicoproteínas de superficie F y G, la envoltura del RSV contiene otra glicoproteína de superficie transmembrana viral: la proteína hidrofóbica pequeña (SH)28,29. En comparación con los anticuerpos contra las proteínas F y G29, los anticuerpos contra la proteína SH muestran menos actividad neutralizante30 probablemente porque la proteína SH no participa en el inicio de la infección viral y tiene una baja inmunogenicidad31. Sin embargo, la replicación del RSV se reduce sin la inducción de VED a través de un mecanismo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) que involucra anticuerpos IgG específicos de SH30,32. Debido a esta menor inducción de actividad neutralizante por el antígeno SH31,33,34, los antígenos basados ​​en SH generalmente se consideran antígenos de subunidades poco atractivos para el desarrollo de vacunas contra el VRS, a pesar de su ventaja de no inducir VED.

Anteriormente, desarrollamos un hidrogel de tamaño nanométrico, un "nanogel", que consiste en un pululano catiónico con grupo colesterilo (cCHP). Descubrimos que nuestro nanogel cCHP es un sistema de administración de vacunas nasales seguro y eficaz que se puede utilizar para estimular el sistema inmunológico de la mucosa nasal mediante el uso de una variedad de antígenos de subunidades23,24,25,26,35,36,37. Debido a su propiedad catiónica, el nanogel de cCHP muestra una adhesión persistente a las superficies de la mucosa nasal cargada negativamente, lo que lleva a una liberación prolongada de antígeno a los sistemas de muestreo y presentación de antígeno de la mucosa nasal38.

Dado que el RSV infecta inicialmente la mucosa respiratoria, es lógico conferir inmunidad protectora no sólo en el compartimento sistémico sino también en la mucosa respiratoria (p. ej., cavidad nasal y pulmón). Por lo tanto, decidimos aprovechar la seguridad de los antígenos basados ​​en SH combinando uno con nuestro vehículo de administración de vacunas basado en nanogel y produjimos una vacuna de subunidad nasal basada en cCHP que contiene el ectodominio de la proteína SH (SHe) como antígeno. Luego examinamos si la vacuna nasal SHe basada en cCHP confería una protección eficaz en la mucosa de las vías respiratorias de ratones y ratas algodoneras sin inducir VED y si esta formulación podría considerarse una vacuna candidata potente para un mayor desarrollo clínico.

Para su uso como antígeno en nuestra vacuna nasal, utilizamos la secuencia peptídica del ectodominio de la proteína SH del subtipo A del RSV (Fig. 1a). El antígeno se construyó utilizando la proteína de superficie neumocócica A (PspA) de Streptococcus pneumoniae como proteína transportadora23,25,35,36,37. Debido a que la proteína SH nativa tiene baja inmunogenicidad31,33,34, mejoramos la inmunogenicidad del antígeno de la vacuna uniendo tres de los péptidos SHe en secuencia a la proteína portadora. El antígeno de la vacuna completo se obtuvo utilizando un sistema de expresión de Escherichia coli y se purificó mediante purificación con etiqueta His (Fig. 1b), y su secuencia de aminoácidos se confirmó mediante análisis de espectrometría de masas. Luego, el antígeno SHe-PspA se formuló con cCHP-nanogel en una proporción molar antígeno:nanogel 1:1, en presencia o ausencia de di-AMP cíclico (cdAMP) como adyuvante, y se utilizó en los estudios de inmunización nasal posteriores. (Figura 1c).

Un análisis de espectrometría de masas reveló que la proteína recombinante derivada de Escherichia coli contenía las secuencias completas de PspA (amarillo), conectores por triplicado (rojo), ectodominios por triplicado de una pequeña proteína hidrófoba (verde), vector (blanco) y etiqueta his (azul). ). b Se produjo un antígeno quimérico conjugado con PspA, marcado con His, en Escherichia coli. La proteína se purificó mediante cromatografía de quelatos metálicos seguido de filtración en gel. Las muestras hervidas en las etapas de purificación se separaron mediante SDS-PAGE. Las bandas de proteínas se visualizaron mediante tinción con azul brillante de Coomassie. Después de la purificación de la muestra, detectamos una proteína de 44 kDa correspondiente a la proteína SHe-PspA (punta de flecha roja). c Esquema del diseño de la vacuna. Se conjugaron tres secuencias SHe repetidas con PspA para mejorar la inmunogenicidad del antígeno.

Para investigar si la vacunación nasal con nuestro antígeno SHe-PspA basado en cCHP (cCHP-[SHe-PspA]) induce respuestas de anticuerpos específicos de SHe, determinamos títulos de anticuerpos específicos de SHe en suero, lavado nasal y líquido de lavado broncoalveolar (BALF). recolectados de ratones inmunizados por vía nasal (NI) con solución salina tamponada con fosfato (PBS, no inmunizados), SHe-PspA sola o cCHP-[SHe-PspA] con o sin cdAMP (Fig. 2a y Tabla 1). Además, determinamos los títulos de anticuerpos en muestras recolectadas de ratones inmunizados por vía intraperitoneal (iPI) con SHe-PspA más adyuvante de Freund incompleto (IFA) o SHe-PspA solo.

un Calendario de vacunación. Se inmunizaron por vía nasal ratones BALB/c hembras de tipo salvaje (WT) tres veces a intervalos semanales y luego se les inmunizó dos veces a intervalos de 2 semanas. Otros ratones WT BALB/c fueron inmunizados por vía intraperitoneal cada 3 semanas un total de tres veces. Los ratones de control (no inmunizados) recibieron solución salina tamponada con fosfato administrada por vía intranasal. b – e Títulos de anticuerpos específicos de SHe una semana después de la inmunización final en suero (b), lavado nasal (d) y líquido de lavado broncoalveolar (BALF) (c, e). Los datos son representativos de cinco o más experimentos independientes, y cada grupo estaba formado por siete o más ratones. Cada círculo negro representa un ratón individual. ND, no detectado en muestras no diluidas. Para el análisis estadístico se utilizó el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con la prueba de comparación múltiple de Tukey. NS, no significativo; *p < 0,05; ***p < 0,001; ****p < 0,0001. Los valores se presentan como medias ± 1 DE.

Se examinaron los títulos de IgG específicos de SHe en suero y BALF (Fig. 2b, c). En ratones NI con cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP, los títulos de suero específico de SHe y BALF IgG fueron significativamente más altos que los de ratones NI con cCHP-[SHe-PspA] o SHe-PspA solo. Además, los títulos séricos y BALF de ratones NI con cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP fueron tan altos como los de ratones iPI con SHe-PspA+IFA. Se examinaron los títulos de IgA específicos de SHe en lavado nasal y BALF (Fig. 2d, e). Los ratones NI con cCHP-[SHe-PspA] con o sin cdAMP mostraron títulos elevados de IgA específica de SHe tanto en el lavado nasal como en BALF. Los ratones que recibieron la formulación que contenía adyuvante mostraron un título de IgA significativamente mayor que cualquiera de los otros ratones, independientemente de la vía de administración. De hecho, los ratones de los otros grupos mostraron muy poca o ninguna inducción de la producción de IgA. Por lo tanto, la NI con cCHP-[SHe-PspA] con o sin cdAMP indujo títulos elevados de IgG sérica específica de SHe y anticuerpos IgA mucosos. Además, cuando se examinaron las respuestas de las células T, se indujeron células T específicas del antígeno productoras de granzima B o interferón (IFN)-γ en pulmones, ganglios linfáticos cervicales y bazos de ratones inmunizados con cCHP-[SHe-PspA] basado en vacuna nasal (Figura complementaria 1).

Para evaluar si la inmunización con cCHP-[SHe-PspA] proporciona inmunidad protectora contra la infección en el tracto respiratorio superior e inferior, los ratones fueron NI con PBS, cCHP-[SHe-PspA] o cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP y luego desafiado con RSV. Además, también se expusieron ratones iPI con SHe-PspA+IFA. Una semana después de la inmunización final, los ratones fueron expuestos a la cepa RSV A2 por vía intratraqueal con 1 × 106 UFP39 para evaluar la eficacia de la vacuna en los pulmones o por vía intranasal con 1 × 105 UFP40 para evaluar la eficacia de la vacuna en los compartimentos nasales. Cuatro días después de la exposición viral, se examinó la carga viral en los pulmones o en los compartimentos nasales de los ratones mediante un ensayo de inmunoplaca (Figura complementaria 2a). Además, el nivel de ARNm de RSV-F y -G se cuantificó mediante RT-PCR y se comparó entre estos diferentes grupos inmunizados.

Debido a que el tracto respiratorio inferior es un sitio importante de daño tisular causado por una infección grave por VRS5, primero examinamos la carga viral en los pulmones de ratones NI o iPI con las diversas formulaciones de vacunas. El análisis de inmunoplaca reveló que los ratones NI con cCHP-[SHe-PspA] + cdAMP tenían títulos virales significativamente más bajos en comparación con los de los ratones no inmunizados, y comparables con los de los otros ratones inmunizados (Fig. 3a). La carga viral en los ratones no inmunizados fue de 6,9 ​​× 105 ± 4,5 × 105. Por el contrario, los ratones inmunizados con cCHP-[SHe-PspA] NI, cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP NI o [SHe-PspA]+IFA iPI los ratones mostraron reducciones de la carga viral (1,9 × 105 ± 1,2 × 105, 9,1 × 104 ± 1,5 × 104 y 6,9 × 104 ± 4,0 × 104 UFP/g, respectivamente). El análisis por RT-PCR confirmó el resultado de la inmunoplaca (Fig. 3b). En el compartimento nasal, tanto el análisis de inmunoplaca como el de RT-PCR mostraron que los ratones NI con cCHP-[SHe-PspA] + cdAMP tenían títulos virales significativamente más bajos en comparación con los de los otros ratones (Fig. 3c, d). La carga viral en los ratones no inmunizados fue de 5,8 × 104 ± 1,4 × 104. Por el contrario, los ratones inmunizados con cCHP-[SHe-PspA] NI, cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP NI y [SHe-PspA]+IFA iPI los ratones mostraron reducciones de la carga viral (3,7 × 104 ± 1,4 × 104, 4,0 × 10 ± 9,8 × 10 y 5,4 × 103 ± 1,9 × 103 UFP/g, respectivamente). De hecho, la carga viral en los compartimentos nasales de ratones NI con cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP estuvo casi por debajo del límite de detección (4,0 × 10 ± 9,8 × 10 UFP).

a – d Una semana después de la inmunización final, los ratones fueron expuestos a la cepa RSV A2, por vía intratraqueal o intranasal, para evaluar la eficacia de la vacuna en los pulmones (a, b) y los compartimentos nasales (c, d), respectivamente. La eliminación viral se determinó mediante ensayo de inmunoplaca (a, c) o RT-PCR en tiempo real (b, d). Los datos son representativos de tres o más experimentos independientes y cada grupo estaba formado por cuatro o más ratones. Para el análisis estadístico se utilizó el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con la prueba de comparación múltiple de Tukey. NS, no significativo; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001. Los valores se presentan como medias1 DE. e, f Localización del VRS después de la infección en los pulmones (e) y los compartimentos nasales (f), detectado mediante ensayo de inmunofluorescencia. Barras de escala: 50 µm. Se prepararon secciones de tejido y se tiñeron con anti-RSV (Cy3 [rojo]), DAPI (azul) y faloidina (iFluro647 [blanco]). Las manchas rojas indican invasión del RSV. Los datos son representativos de tres experimentos independientes y cada grupo estaba formado por dos o tres ratones.

A continuación, evaluamos la infiltración viral en el tejido del compartimento pulmonar y nasal mediante inmunotinción fluorescente de muestras obtenidas de ratones NI con PBS o cCHP-[SHe-PspA] con cdAMP o ratones iPI con SHe-PspA+IFA (Fig. 3e, f ). 4 días después de la exposición viral, los ratones NI con cCHP-[SHe-PspA] + cdAMP o iPI con SHe-PspA + IFA casi no mostraron infiltración viral en el pulmón (Fig. 3e). En los compartimentos nasales, los ratones NI con cCHP-[SHe-PspA] + cdAMP mostraron menos infiltración viral en comparación con los ratones iPI con SHe-PspA + IFA (Fig. 3f).

Hasta ahora, nuestros resultados muestran que cCHP-[SHe-PspA] induce eficazmente respuestas de anticuerpos IgA específicos de SHe en las secreciones del tracto respiratorio (Fig. 2c, e). A continuación, utilizamos un ensayo de perlas de unión a virus y una clasificación de células activada por fluorescencia36 para examinar si los anticuerpos inducidos41 se unen directamente al RSV (Figura complementaria 3). RSV A2 se conjugó con perlas de unión a virus de intercambio aniónico fuerte y se incubó con muestras de lavado nasal de ratón (70 µl/muestra) recolectadas de ratones BALB/c de tipo salvaje (WT) NI con PBS, cCHP-[SHe-PspA] o cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP. Además, se examinaron muestras de lavado nasal de ratones BALB/c NI con deficiencia de receptor polimérico de Ig (pIgR-/-) con cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP para abordar directamente el papel de los anticuerpos IgA de la mucosa específicos de SHe.

Como se esperaba, los lavados nasales de los ratones NI WT contenían niveles significativamente más altos de anticuerpos IgA e IgG específicos de SHe en comparación con los de los ratones WT inmunizados con PBS, que mostraron niveles de anticuerpos muy bajos a indetectables como se describió anteriormente (Fig. 2b-e). . Además, se descubrió que los anticuerpos recolectados de ratones NI se unen directamente a la superficie del RSV A2 (Fig. 4a, b). Las capacidades de unión al RSV de los anticuerpos IgA e IgG específicos de antígeno en lavados nasales de ratones NI inmunizados con cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP fueron más fuertes que las de IgA e IgG de ratones NI inmunizados con cCHP-[SHe-PspA] sin cdAMP. Además, cuando se comparó la capacidad de unión del RSV entre los dos isotipos en lavados nasales de diferentes grupos de NI, la capacidad de unión del anticuerpo IgA fue mayor que la del anticuerpo IgG (Fig. 4a, b). Estos hallazgos indican que los anticuerpos IgA específicos de antígeno inducidos por vía nasal en los compartimentos nasales desempeñan un papel fundamental en la inhibición de la unión del RSV a la cavidad mucosa de las vías respiratorias.

a, b La unión a la superficie del RSV mediante lavado nasal. Se detectó IgA (a) e IgG (b) específicas de SHe mediante perlas de unión y análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia. RSV A2 se conjugó con perlas de unión a virus (RSV-Beads) y se incubó con lavado nasal de ratón. La unión del anticuerpo se evaluó midiendo la intensidad del marcaje fluorescente mediante citometría de flujo, y la intensidad fluorescente media (MFI) de cada grupo se midió y se determinó como MFI relativa con el valor de RSV-Beads solo establecido en 1. Los datos son representativos de tres experimentos independientes, y cada grupo estaba formado por cinco o seis ratones. c, d Lavado nasal con IgA específica de SHe (c) e IgG sérica específica de SHe (d) en ratones pIgR WT (BALB/c) y pIgR-/-. e Se expusieron ratones BALB/c no vacunados por vía intranasal a RSV incubado con lavado nasal de ratones inmunizados. Cuatro días después, se determinó el título viral de los compartimentos nasales mediante ensayo de placa. Los datos son representativos de tres o más experimentos independientes, y cada grupo estaba formado por cuatro o más ratones (a – e). Para el análisis estadístico se utilizó el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con la prueba de comparación múltiple de Tukey (a, b, e) y la prueba t de Student de dos colas (c, d). *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001. Los valores se presentan como medias ± 1 DE.

Para confirmar aún más el papel inhibidor de la IgA de la cavidad nasal contra la unión del RSV, los ratones pIgR-/- BALB/c, que carecen de la capacidad de producir IgA secretora mucosa específica de antígeno42,43, fueron NI con cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP y se descubrió que mostraban niveles significativamente más bajos o indetectables de IgA específica de SHe en lavados nasales en comparación con los de ratones WT (Fig. 4c). Por el contrario, se observaron los mismos niveles de IgG sérica específica de SHe en ratones pIgR -/- y WT BALB / c (Fig. 4d). Aunque los lavados nasales de ratones NI pIgR -/- contenían IgG específica de antígeno capaz de unirse al RSV, la capacidad de unión del anticuerpo fue tan débil como la de la IgG en ratones administrados por vía nasal (no inmunizados) con PBS (Fig. 4a, b). Estos hallazgos respaldan el hallazgo anterior de que la IgA específica de antígeno en los compartimentos nasales desempeña un papel fundamental en la prevención de la unión del VRS a la mucosa respiratoria superior.

Para demostrar el papel crítico de los anticuerpos IgA en la cavidad nasal para el control de la infección por RSV del tracto respiratorio superior, el RSV se preincubó con las mismas muestras de lavado nasal obtenidas de los ratones BALB/c (p. ej., WT y pIgR-/-). NI con cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP. Se utilizaron como control lavados nasales de ratones NI con PBS. Luego, el RSV pretratado se usó para la provocación intranasal de ratones BALB/c que no habían recibido previamente inmunización (Figura complementaria 4). Cuatro días después de la provocación intranasal, se determinaron los títulos virales en los compartimentos nasales mediante un ensayo de inmunoplaca. En comparación con los lavados nasales de ratones NI con PBS, los de ratones WT BALB/c NI con cCHP-[SHe-PspA] con o sin cdAMP dieron como resultado niveles significativamente reducidos de invasión de RSV (Fig. 4e), mientras que los lavados nasales de pIgR -/- ratones NI con cCHP-[SHe-PspA] + cdAMP que contienen anticuerpos IgG específicos de antígeno, pero no IgA, no tuvieron efecto sobre la invasión viral (Fig. 4e). La carga viral en los ratones que recibieron lavado nasal de ratones WT BALB/c NI con PBS (es decir, ratones no inmunizados) fue de 8,6 × 104 ± 2,6 × 104 UFP/g. Por el contrario, se observaron reducciones de las cargas virales en los ratones que recibieron lavados nasales de ratones WT BALB/c NI con cCHP-[SHe-PspA] (1,6 × 104 ± 8,9 × 103 UFP/g) y ratones WT BALB/c NI con cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP (8,6 × 103 ± 5,6 × 103 UFP/g). Cabe señalar que la carga viral en ratones que recibieron lavados nasales de ratones pIgR-/- NI secretores carentes de IgA con cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP fue elevada (9,3 × 104 ± 1,6 × 104 UFP/g). Estos resultados demuestran que los anticuerpos IgA nasales específicos de SHe desempeñan un papel importante en la inhibición de la infección por RSV en el sitio de invasión, la superficie mucosa de las vías respiratorias.

Además de la inducción de inmunidad protectora de la mucosa de las vías respiratorias (Fig. 3), nuestros resultados demuestran que cCHP-[SHe-PspA] induce respuestas de anticuerpos IgG séricos específicos de antígeno equivalentes a las inducidas por la inmunización sistémica (Figs. 2b, d, 3a). , ser). Sobre la base de estos hallazgos, utilizamos un ensayo de reducción de placa in vitro para examinar si la IgG sérica específica de SHe y la IgA de lavado nasal de ratones inmunizados pueden neutralizar directamente el VSR; sin embargo, no se encontró que ninguno de los anticuerpos ejerciera un efecto neutralizante directo contra el VSR (Figura complementaria 5), ​​como se informó anteriormente30,31. Por lo tanto, a continuación analizamos los mecanismos celulares y moleculares de la protección sistémica provocada por cCHP-[SHe-PspA] contra el VRS.

Se ha demostrado que los anticuerpos que se unen a los antígenos de la superficie del virus pueden cooperar con los leucocitos para matar o eliminar las células infectadas por el virus a través de receptores Fc expresados ​​en la superficie de varios tipos de leucocitos44,45. Para probar si el receptor Fcγ (FcγR) está involucrado en la prevención de la infección por RSV, inmunizamos ratones de base diabéticos no obesos (NOD) WT y FcγR nulos46 utilizando el protocolo de inmunización ya descrito (Tabla 1 y Fig. 2a). Confirmamos que no hubo diferencias significativas en las respuestas de anticuerpos IgG específicos de SHe en suero o IgA específicos de SHe en lavado nasal entre los ratones NOD WT y FcγR nulos (Fig. 5a, b). 1 semana después de la inmunización final, los ratones fueron expuestos por vía intratraqueal a 1 × 106 UFP de RSV y, 4 días después de la exposición viral, se determinaron las cargas virales pulmonares. NI con cCHP-[SHe-PspA] + cdAMP redujo significativamente la replicación de RSV en los pulmones de ratones WT NOD pero no en ratones NOD nulos con FcγR (Fig. 5c). Estos resultados indican que los anticuerpos IgG séricos específicos de SHe inducidos por NI con cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP contribuyen a la respuesta inmune mediada por el receptor Fc contra la infección pulmonar por RSV (p. ej., ADCC), al igual que la IgG específica de SHe. Anticuerpos inducidos por inmunización sistémica.

Una semana después de la inmunización final, los ratones NOD WT y los ratones NOD FcγR nulos fueron expuestos por vía intratraqueal a la cepa RSV A2. a, b IgG sérica específica de SHe e IgA específica de SHe para lavado nasal en ratones NOD WT y NOD FcγR nulos. Los datos son representativos de tres experimentos independientes y cada grupo estaba formado por seis ratones. c Eliminación viral de los pulmones, determinada mediante la detección del ARNm de RSV-F y -G mediante RT-PCR en tiempo real. Los datos son representativos de tres experimentos independientes y cada grupo estaba formado por seis o más ratones. Para el análisis estadístico se utilizaron la prueba t de Student de dos colas (a, b) y el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con la prueba de comparación múltiple de Tukey (c). NS, no significativo; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001. Los valores se presentan como medias ± 1 DE.

La DEV es una complicación reconocida provocada por las vacunas contra el VRS11,12. Por lo tanto, investigamos si NI con cCHP-[SHe-PspA] + cdAMP inducía VED utilizando el modelo FI-RSV VED previamente informado40 con ligeras modificaciones (Figura complementaria 6). La VED se evaluó el día 8 después de la exposición intratraqueal al RSV en ratones NI con PBS o cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP comparando su respuesta inmune de tipo Th2 [es decir, producción de citoquinas de tipo Th2 e infiltración de eosinófilos en el tejido pulmonar47,48 ] con el de los ratones modelo FI-RSV VED. La respuesta de las citoquinas de tipo Th2 (es decir, la expresión de interleucina-4, -5 y -13), determinada por RT-PCR en tiempo real, fue comparable entre los ratones NI con PBS o cCHP-[SHe-PspA]+ cdAMP (Figura 6a). Por el contrario, se observaron aumentos significativos en la respuesta de citocinas en los ratones modelo FI-RSV VED (Fig. 6a). La infiltración de eosinófilos en BALF también se examinó utilizando la fracción de granulocitos Siglec-F+ y CD11b+, como se informó anteriormente49 (Fig. 6b), y se observó una infiltración de eosinófilos significativamente mayor en los ratones modelo FI-RSV VED en comparación con la de los ratones NI con cCHP-[SHe-PspA] + cdAMP (Fig. 6c). Además, el examen histológico de los pulmones mostró una marcada infiltración de eosinófilos y colapso alveolar en los pulmones de ratones modelo FI-RSV VED, pero ninguna infiltración de células inflamatorias o daño tisular en los ratones NI con cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP (Fig. 6d). Estos resultados sugieren que cCHP-[SHe-PspA] no causa VED.

a Niveles de expresión de ARNm de las citocinas de tipo Th2 interleucina (IL) -4, -5 y -13. b Estrategia de activación para el análisis de citometría de flujo de células en líquido de lavado broncoalveolar (BALF). Los eosinófilos se separaron como células Siglec-F+CD11b+ entre la población de granulocitos mediante dispersión frontal y lateral. c Población de eosinófilos entre los granulocitos en BALF. Los datos son representativos de tres experimentos independientes y cada grupo estaba formado por cinco o más ratones. Para el análisis estadístico (a, c) se utilizó el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con comparaciones múltiples de Tukey. NS, no significativo; ****p < 0,001. Los valores se presentan como medias ± 1 DE. d Las secciones de tejido pulmonar recolectadas el día 8 después de la infección por VRS se tiñeron con hematoxilina y eosina. Barras de escala: 50 µm. Los datos son representativos de tres experimentos independientes y cada grupo estaba formado por dos o tres ratones.

Para confirmar aún más la eficacia de cCHP-[SHe-PspA], examinamos las respuestas en un modelo animal experimental de eficacia de la vacuna RSV estándar, la rata algodonera (Sigmodon hispidus)50,51,52. Para evaluar si cCHP-[SHe-PspA] induce inmunidad protectora contra la infección por RSV tanto en el tracto respiratorio superior como en el inferior, las ratas algodoneras fueron NI con PBS, SHe-PspA sola, cCHP-[SHe-PspA] o cCHP-[SHe-PspA]. -PspA]+cdAMP. Otras ratas algodoneras fueron iPI con SHe-PspA + IFA (Tabla 2 y Fig. 7a). Una semana después de la inmunización final, se determinaron los títulos de anticuerpos específicos de SHe en el suero y en el lavado nasal de las ratas algodoneras. Los títulos séricos de IgG específica de SHe se elevaron en los ratones NI con cCHP-[SHe-PspA] o cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP o iPI con SHe-PspA+IFA, mientras que no se detectó IgG específica de SHe en los ratones. NI con PBS o SHe-PspA solo (Fig. 7b). La IgA específica de SHe se indujo en la cavidad nasal solo en las ratas algodoneras NI con cCHP-[SHe-PspA] o cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP (Fig. 7a, c. Estos hallazgos fueron consistentes con los datos obtenidos en ratones (Fig. 2b, c).

un Calendario de vacunación. Se inmunizaron por vía nasal ratas algodoneras hembras de tipo salvaje (Sigmodon hispidus) tres veces a intervalos semanales y luego se les inmunizó dos veces a intervalos de 2 semanas. Otras ratas algodoneras fueron inmunizadas por vía intraperitoneal cada 3 semanas un total de tres veces. El grupo de control (no inmunizado) recibió PBS administrado por vía intranasal. b, c Títulos de anticuerpos específicos de SHe una semana después de la inmunización final en suero y lavado nasal. Los datos son representativos de tres experimentos y cada grupo estaba formado por cinco o más ratones. ND, no detectado en muestras no diluidas. d, e Eliminación viral de los pulmones y los compartimentos nasales, según lo determinado mediante ensayo de inmunoplaca. Los datos son representativos de tres experimentos independientes, y cada grupo estaba formado por cuatro o más ratones (a – d). Para el análisis estadístico se utilizó el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con la prueba de comparación múltiple de Tukey. NS, no significativo; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001. Los valores se presentan como medias ± 1 DE.

A continuación, realizamos una exposición al RSV en ratas algodoneras inmunizadas. Las ratas algodoneras fueron expuestas por vía intranasal a la cepa RSV A2 (3,0 × 105 PFU) de acuerdo con un protocolo previamente establecido para evaluar la eficacia de la vacuna contra la infección por RSV en los pulmones y los compartimentos nasales40. Cuatro días después de la exposición viral, se evaluaron las cargas virales mediante un ensayo de inmunoplaca (Figura complementaria 2b). En las ratas algodoneras NI con cCHP-[SHe-PspA] + cdAMP, las cargas virales en los pulmones fueron significativamente más bajas que las de las ratas algodoneras NI con PBS o cCHP-[SHe-PspA] (Fig. 7d). La carga viral en las ratas algodoneras no inmunizadas fue de 9,6 × 104 ± 1,0 × 104 UFP/g. Se observaron reducciones de la carga viral en ratas algodoneras inmunizadas con cCHP-[SHe-PspA] NI, cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP NI o [SHe-PspA]+IFA iPI (3,5 × 104 ± 1,4 × 104, 8,0 × 103 ± 3,6 × 103 y 1,9 × 104 ± 9,2 × 103 UFP/g, respectivamente). Además, las ratas algodoneras iPI con SHe-PspA + IFA también mostraron una carga viral baja en los pulmones (Fig. 7d). En los compartimentos nasales, la NI con cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP dio como resultado cargas virales significativamente reducidas en comparación con aquellas después de la NI con PBS o iPI con SHe-PspA+IFA (Fig. 7e). La carga viral en las ratas algodoneras no inmunizadas fue de 4,0 × 104 ± 1,2 × 104 UFP/g. Se observaron reducciones de la carga viral en las ratas algodoneras inmunizadas con cCHP-[SHe-PspA] NI, cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP NI o [SHe-PspA]+IFA iPI (2,1 × 104 ± 1,0 × 104, 6,7 × 103 ± 1,1 × 104 y 2,7 ​​× 104 ± 6,5 × 103 UFP/g, respectivamente). En conjunto, estos hallazgos indican además que cCHP-[SHe-PspA] es una vacuna candidata atractiva para la prevención de la infección por VRS.

El RSV se caracteriza por sus tres proteínas de superficie transmembrana: proteínas F, G y SH. La mayoría de las vacunas anti-VSR desarrolladas hasta la fecha utilizan la proteína de superficie F como antígeno53,54 y el receptor ha sido identificado recientemente55. Además, las vacunas basadas en proteína F para la inmunidad materna20 y adultos mayores21,22 han mostrado resultados prometedores en ensayos clínicos de fase III. Sin embargo, estas vacunas se han administrado mediante inyección. Además, aunque la proteína de superficie F está altamente conservada en todo el espectro de las cepas de RSV y es esencial para la viabilidad viral14, el virus RSV puede realizar un cambio conformacional en la proteína F para evitar la neutralización de anticuerpos28,56,57,58,59. Mientras tanto, la proteína de superficie G es la más variable de las proteínas de superficie del RSV60 e induce respuestas inmunes aberrantes sesgadas por Th2 que causan VED FI-RSV a través de señalización 6 específica de detención del crecimiento40. Por tanto, aún quedan varios obstáculos por superar antes de poder desarrollar una vacuna nasal eficaz basada en estos dos antígenos. En este estudio, nos hemos concentrado en el desarrollo de vacunas nasales utilizando el ectodominio de la proteína SH (SHe) como antígeno de la vacuna30,32 implementado a través de nuestro sistema de administración de nanogel cCHP23,24,25,26,35,36,37,38,61 .

La proteína SH es una proteína de membrana integral de tipo II de 64 (RSV/A) o 65 (RSV/B)-aminoácidos62. Aunque la función de la proteína SH aún no está clara63, puede desempeñar un papel en la fusión viral64,65 o en el cambio de la permeabilidad de la membrana66. Sin embargo, el RSV que carece del gen SH (RSVΔSH) es viable y puede replicarse tan bien como el WT RSV67,68, lo que indica que la proteína SH no es necesaria para la entrada del virus en las células huésped65. Teniendo en cuenta estos antecedentes, se considera que la proteína SH no provoca niveles elevados de anticuerpos neutralizantes ni contribuye a la defensa del huésped ante la infección, a diferencia de las otras dos proteínas de superficie principales, F y G29. De manera similar, SHe, el ectodominio de la proteína SH, consta de 23 (RSV/A) o 24 (RSV/B) aminoácidos y parece tener una inmunogenicidad débil31,33,34. De hecho, se informó que los niveles de IgG específica de SHe son muy bajos en sueros convalecientes de ratones BALB/c y ratas algodoneras infectadas con RSV y en sueros de referencia humanos30. Debido a su baja inmunogenicidad31,33,34, no se ha priorizado el desarrollo de SHe como vacuna en comparación con las proteínas F y G. En contra de esta tendencia, hemos desarrollado un nuevo antígeno quimérico en el que tres SHe están unidas en secuencia a un portador. proteína (PspA) (Fig. 1a-c) y luego se incorpora a un vehículo de administración nasal eficaz, nuestro nanogel catiónico cCHP23,24,25,26,35,36,37,38,61 (Fig. 1c).

La vía nasal de vacunación es probablemente la estrategia más eficaz para provocar inmunidad protectora contra infecciones respiratorias como el VSR. De hecho, la vacunación nasal puede inducir respuestas inmunes tanto sistémicas como mucosas específicas de antígeno69, mientras que las vacunas convencionales de tipo inyectable son menos efectivas para inducir inmunidad mucosa a pesar de la inducción de respuestas inmunes específicas de antígeno efectivas en el compartimento sistémico70. Además, las vacunas nasales tienen la capacidad de inducir altos niveles de anticuerpos IgA neutralizantes en las secreciones de las vías respiratorias, lo que se asocia directamente con una respuesta inmune protectora contra el VRS71,72,73. Las vacunas nasales inducen inmunidad mucosa al administrar el antígeno de la vacuna a las células M clásicas y respiratorias que toman muestras de antígeno y que residen en el epitelio monocapa de la cavidad nasal, incluido el del tejido linfoide asociado a la nasofaringe y la cavidad nasal74. Sin embargo, la vacuna que contiene el antígeno solo suele ser poco inmunogénica. Para abordar este problema, desarrollamos un nanogel de cCHP para usar en la administración de antígeno a la mucosa nasal38, y hemos demostrado su eficacia y seguridad en modelos de ratón23,26 y de primates no humanos36,37,75 contra Streptococcus pneumoniae. infección. Por lo tanto, utilizamos este sistema de administración de nanogel de cCHP para desarrollar una vacuna nasal contra el VRS que contiene nuestro antígeno proteico quimérico.

Aquí, encontramos que nuestra vacuna nasal SHe basada en cCHP recientemente desarrollada indujo respuestas de anticuerpos IgA mucosas específicas de SHe y IgG sistémicas en ratones (Fig. 2b-e). Además, la adición de cdAMP como adyuvante nasal indujo títulos de anticuerpos significativamente más altos que los obtenidos sin cdAMP (Fig. 2b-e). La inmunización con cCHP-[SHe-PspA] más adyuvante dio como resultado niveles comparables de títulos de IgG específicos de SHe que se observaron en ratones inmunizados sistémicamente con SHe-PspA más IFA (Fig. 2b, d). Aquí, cabe señalar que las respuestas de anticuerpos IgA específicos de SHe de la mucosa se indujeron solo en ratones NI (Fig. 2c, e). Para evaluar las propiedades funcionales de los anticuerpos específicos de SHe, los ratones inmunizados fueron expuestos por vía mucosa a RSV vivo. Nuestra vacuna nasal SHe basada en cCHP redujo la replicación viral en los compartimentos nasales y los pulmones (Fig. 3a-f), lo que demuestra que la vacuna es eficaz para el control de la infección por VRS en el tracto respiratorio superior e inferior (Fig. 3a-f). ). La inhibición de la replicación del RSV en los pulmones fue similar entre los ratones inmunizados independientemente de las rutas de inmunización (Fig. 3a, b, e). En los compartimentos nasales, los ratones NI con cCHP-[SHe-PspA] + cdAMP mostraron un nivel significativamente bajo de replicación del VRS en comparación con el de los otros grupos de ratones inmunizados (Fig. 3c, d). Estos resultados fueron respaldados por análisis inmunohistoquímicos utilizando secciones de pulmón y mucosa nasal (Fig. 3e, f). En conjunto, estos resultados muestran que la inducción de anticuerpos IgA mucosos específicos de antígeno y anticuerpos IgG séricos desempeña un papel central en la inhibición de la replicación del VRS en los tractos respiratorios superior e inferior, respectivamente.

Informes anteriores han demostrado que los anticuerpos IgG específicos de SHe no exhiben un efecto neutralizante directo contra el RSV30,31. De hecho, confirmamos que los anticuerpos IgG séricos específicos de SHe y IgA de lavado nasal inducidos por nuestra vacuna nasal no tuvieron ningún efecto neutralizante contra el VRS (Figura complementaria 5). Por lo tanto, consideramos cómo los anticuerpos IgA específicos de SHe inducidos en los compartimentos nasales eliminan el VRS en el tracto respiratorio superior si no poseen una función neutralizante directa contra el VRS. Evaluamos las capacidades de unión de los anticuerpos IgA e IgG específicos de SHe contra el VRS en lavados nasales recolectados de ratones inmunizados (Fig. 4a, b). Anticuerpos IgA e IgG específicos de SHe de lavados nasales de ratones NI con cCHP-[SHe-PspA], ambos unidos al RSV (Fig. 4a, b); sin embargo, la intensidad de la unión de IgG fue menor que la de IgA. Además, la IgG detectada en la mucosa respiratoria superior se acumula allí mediante difusión pasiva desde el suero76, mientras que la IgA es producida continuamente por las células plasmáticas residentes en el compartimento mucoso77,78. Aunque puede haber cierta inmunidad aditiva de la IgG específica de SHe en el suero de los lavados nasales, la principal inmunidad protectora la proporcionaron los anticuerpos IgA mucosos específicos de SHe.

Para demostrar aún más el papel de los anticuerpos IgA nasales específicos de SHe, se realizó una prueba de provocación intranasal utilizando RSV preincubado con o sin lavados nasales de ratones inmunizados por vía nasal con nuestra vacuna SHe basada en cCHP. Para la preincubación del RSV se utilizaron lavados nasales de ratones pIgR-/- inmunizados por vía nasal, que son incapaces de secretar anticuerpos IgA mucosos específicos de SHe. El VSR pretratado con lavados nasales de ratones pIgR -/- inmunizados causó infección, mientras que el VRS pretratado con lavados nasales de ratones WT inmunizados nasalmente no (Fig. 4e). Esto sugiere que los anticuerpos IgA específicos de SHe inducidos por la vacuna nasal funcionan como un mecanismo de defensa inmune activo en el tracto respiratorio superior. De hecho, grandes cantidades de anticuerpos IgA específicos de SHe en los lavados nasales podrían unirse fuertemente al RSV (Fig. 4a, c), lo que lleva a una reducción significativa de la replicación del virus (Fig. 4e). Con base en estos hallazgos, parece que los anticuerpos IgA específicos de SHe no exhiben un efecto neutralizante clásico de inhibición de la replicación del RSV (Figura complementaria 5), ​​aunque pueden unirse al RSV para inhibir el acceso del virus a las células epiteliales de la mucosa respiratoria superior. (Figura 4a, e).

La proteína SH promueve una respuesta inmune protectora en modelos animales de infección por RSV a través de un mecanismo ADCC mediado por el receptor Fc30,32. Por lo tanto, es importante dilucidar si nuestros anticuerpos IgG específicos de SHe inducidos por vacuna basados ​​en cCHP exhiben la misma inmunidad protectora mediada por el receptor Fc. Descubrimos que los ratones FcγR nulos en el fondo NOD que recibieron cCHP-[SHe-PspA] nasal no lograron mostrar ninguna protección contra la exposición al RSV, a pesar de la presencia de altos niveles de anticuerpos IgG séricos específicos de SHe (Fig. 5a, c). Por el contrario, los ratones WT NOD NI con cCHP-[SHe-PspA] mostraron protección contra la infección intratraqueal por VRS y produjeron altos niveles de anticuerpos IgG séricos específicos de SHe (Fig. 5a, c). Estos resultados indican que las interacciones entre células mediadas por el receptor Fc (p. ej., ADCC)79 son muy probablemente el mecanismo protector de los anticuerpos IgG sistémicos específicos de SHe inducidos por nuestra vacuna nasal basada en cCHP. En apoyo de esta opinión, se ha informado que algunas vacunas contra el virus de la influenza80 y la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana81 utilizan ADCC como mecanismo protector contra las infecciones virales; Estos informes muestran que estas vacunas inducen la supresión viral sin la inducción de ningún anticuerpo neutralizante80,81. Por lo tanto, aunque nuestros resultados demuestran que los anticuerpos específicos de SHe inducidos por nuestra vacuna nasal no tienen ningún efecto neutralizante del virus, aún es posible que nuestra vacuna pueda controlar la infección por VRS en el entorno clínico porque puede inducir anticuerpos IgG específicos de SHe. y respuestas inmunitarias mediadas por el receptor Fc (p. ej., ADCC) para protección sistémica, así como anticuerpos IgA específicos de SHe en los compartimentos nasales que se unen fuertemente al RSV para bloquear la invasión viral en la superficie de la mucosa. Un estudio reciente en primates no humanos con vacunas nasales con antígenos relacionados con la proteína F también demostró hallazgos similares a los resultados de nuestra vacuna nasal basada en SHe (Figs. 4, 5) con el control de las infecciones de las vías respiratorias superiores e inferiores mediante anticuerpos IgA específicos del virus. y mecanismos efectores mediados por Fc, respectivamente82. Además, nuestro estudio proporcionó evidencia de que la vacuna nasal basada en cCHP-[SHe-PspA] es capaz de inducir células T específicas de antígeno que producen granzima B o IFN-γ (Figura 1 complementaria), lo que sugiere una posible contribución de la inmunidad mediada por células. En un estudio separado, nuestros esfuerzos apuntan actualmente a caracterizar más detalladamente la inmunidad de las células T específicas del RSV, incluidas las contribuciones de las células de memoria y efectoras T específicas de SHe residenciales y circulantes.

La seguridad es otra preocupación importante en el desarrollo de vacunas, especialmente para las vacunas contra el VRS porque en el pasado ha habido casos de efectos secundarios graves y dañinos y VED FI-RSV causados ​​por las vacunas contra el VRS11,12. Utilizamos el modelo FI-RSV VED40 para evaluar la seguridad de nuestra vacuna nasal SHe basada en cCHP examinando si la infección por RSV indujo reacciones alérgicas graves mediadas por Th2 en ratones NI. No se observaron síntomas clínicos obvios de tipo alérgico ni respuestas aberrantes de tipo Th2 que recuerden a FI-RSV VED en los ratones inmunizados por vía nasal (Fig. 6a-d). Estos resultados proporcionan evidencia que respalda la seguridad de nuestra vacuna nasal SHe-PspA basada en cCHP.

El modelo de rata algodonera RSV se considera un sistema aplicable en humanos para pruebas de vacunas porque el modelo muestra una patología respiratoria similar después de la infección por RSV a la observada en humanos50,51,52. De hecho, el valor traslacional del sistema de ratas algodoneras está bien establecido50 y se ha convertido en un modelo reconocido para el estudio de la infección por VRS83. Utilizando ratas algodoneras, pudimos reproducir los resultados obtenidos de nuestros experimentos con ratones (Fig. 7a-e). Las ratas algodoneras NI con cCHP-[SHe-PspA] + cdAMP mostraron niveles aumentados de IgG sérica específica de SHe y anticuerpos IgA mucosos (Fig. 7b, c). En un estudio de provocación intranasal con RSV, ratas algodoneras NI con cCHP-[SHe-PspA] + cdAMP mostraron efectos protectores tanto en el tracto respiratorio superior como en el inferior (Fig. 7d, e), con una replicación del RSV significativamente suprimida en el tracto respiratorio superior en comparación con con el de ratas algodoneras inmunizadas sistémicamente (Fig. 7e). Por lo tanto, al utilizar el modelo de rata algodonera, pudimos proporcionar evidencia adicional que respalda la eficacia de nuestra vacuna nasal SHe basada en cCHP contra la infección por VRS.

El estudio actual ha proporcionado una base sólida de prueba de concepto para la inducción de inmunidad protectora de las mucosas y sistémica contra el VRS mediante la inmunización nasal con una nueva formulación candidata a vacuna de cCHP-[SHe-PspA]. Por lo tanto, el estudio ha demostrado que un antígeno candidato a vacuna débil pero seguro, SHe, podría usarse para el desarrollo de una vacuna que utilice un sistema de administración de vacuna nasal, cCHP y/o cdAMP candidato adyuvante, utilizando modelos de ratón y rata algodonera. Sin embargo, nos damos cuenta de que la frecuencia de las inmunizaciones que hemos adoptado en este estudio podría ser demasiada para considerarla en futuras aplicaciones clínicas. En nuestro próximo estudio preclínico, optimizaremos este calendario de vacunación para que sea más adecuado para la práctica clínica.

En conclusión, hemos demostrado aquí que nuestra vacuna nasal SHe basada en cCHP proporciona inmunidad protectora específica del VRS en los compartimentos mucoso y sistémico de ratones y ratas algodoneras sin causar DEV. Por lo tanto, esta formulación es un candidato prometedor para el desarrollo como vacuna para la prevención de la infección por VRS. Se justifican más estudios, incluidas pruebas clínicas.

La cepa A2 de RSV se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) (Número ATCC VR-1540TM, Número de lote: 70021273). El RSV se propagó en células HEp-2 cultivadas (ATCC), se recogió y se almacenó a -80 °C como reserva. Los títulos virales de la unidad infecciosa en las reservas de RSV se cuantificaron por cuadruplicado en células HEp-2 mediante ensayo de inmunoplaca.

Se adquirieron ratones BALB/c de Japan SLC (Shizuoka, Japón). Los ratones pIgR-/- en el fondo BALB/c se mantuvieron mediante pases en nuestro laboratorio42,43, los ratones NOD se adquirieron de CLEA Japón (Tokio, Japón). Se obtuvieron ratones FcγR-null (tanto FcR de cadena γ común [FcRγ] como deficientes en FcγRIIB) en el fondo NOD46 de RIKEN BRC (Tsukuba, Japón). Todos los ratones eran hembras y tenían entre 7 y 8 semanas de edad al comienzo del estudio. Se compraron ratas algodoneras hembra (edad, 6 semanas) de ENVIGO (Indianápolis, IN, EE. UU.) a través de Japan SLC (Shizuoka, Japón). Todos los roedores se alojaron con comida y agua ad libitum en un ciclo estándar de luz/oscuridad de 12 h/12 ​​h.

Desarrollamos un antígeno SHe-PspA en el que se utilizó la proteína de superficie neumocócica A (PspA) como proteína portadora para mejorar la inmunogenicidad de SHe84. El antígeno de la vacuna SHe-PspA comprendía tres repeticiones del péptido SHe de la cepa RSV A (NKLSEYNVFHNKTFELPRARVNT) en el extremo C-terminal y la secuencia de PspA de la cepa Rx1 de S. pneumoniae (pUAB055; aminoácidos 1–302) (n.º de acceso a GenBank M74122) en el extremo N. Las secuencias SHe individuales estaban espaciadas por un conector GGGGS flexible. El gen SHe-PspA fue sintetizado por Takara Bio Inc. (Otsu, Japón) y, tras la digestión con las enzimas de restricción Nco I y Xho I (Takara Bio Inc.), se insertó en el vector pET-20b (+) (Novagen, Inc., Madison, WI) que incluye una etiqueta His con terminal C. Se transformaron células competentes Rosetta2 (DE3) pLysS (Novagen, Inc.) con el plásmido que codifica SHe-PspA según el protocolo del fabricante. El transformante resultante se inoculó en caldo de lisogenia que contenía 100 µg/ml de ampicilina y se incubó con agitación a 37 °C hasta que el valor de DO600 fue de 0,5 a 0,8. Después de la inducción durante 3,5 h con isopropil β-d-1-tiogalactopiranósido 0,4 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japón), las células se recogieron mediante centrifugación a 4620 x g durante 15 minutos a 4 °C y luego se extraída como una proteína soluble en PBS (pH 7,4) que contiene imidazol 40 mM e inhibidor de proteasa (completo; Roche Diagnostics KK, Tokio, Japón). Luego, la proteína deseada se purificó mediante sal con sulfato de amonio (80% de saturación) seguido de diálisis contra un tampón de fosfato de sodio que contenía imidazol 40 mM utilizando un tubo de celulosa sin costura (Sanko Junyaku Co., Ltd., Tokio, Japón). Luego, la proteína se purificó mediante cromatografía de afinidad de níquel (GE Healthcare Bio-Sciences KK, Tokio, Japón) seguido de filtración en gel en una columna Sephadex G-100 (GE Healthcare Bio-Sciences KK) (2,5 x 100 cm) usando PBS. . La pureza de la vacuna SHe-PspA fue superior al 95% según SDS-PAGE (Fig. 1a). Después de SDS-PAGE con tinción CBB, se cortó del gel la banda SHe-PspA con un peso molecular de 50–55 kDa y se digirió durante la noche a 37 °C con 0,2 µg de tripsina (grado de secuencia, Promega, Madison, WI). , desalado y luego concentrado a un volumen de 20 mL. Luego, las muestras se inyectaron en un sistema de cromatografía líquida de nanoflujo directo (Dina; KYA Technologies) y se rociaron en un espectrómetro de masas Orbitrap con trampa de iones lineal (LTQ Orbitrap; Thermo Fischer Scientific, Suwanee, GA) (Fig. 1b). El análisis de los datos utilizando el servidor de búsqueda Mascot confirmó las secuencias completas de aminoácidos de SHe-PspA expresadas en E. coli.

El nanogel cCHP se sintetizó como se describió anteriormente85. Para la formulación de la vacuna SHe-PspA, mezclamos el cCHP-nanogel37 en una proporción molecular de 1:1 con SHe-PspA antes de incubar durante 1 hora a 40 °C para incorporar SHe-PspA en las nanopartículas cargadas catiónicamente (Fig. 1c). Se confirmó que la contaminación por lipopolisacáridos del nanogel cCHP o la proteína SHe-PspA recombinante era inferior a 10 unidades de endotoxina/mg de proteína mediante una prueba de Limulus (Fujifilm Wako Chemicals, Tokio, Japón).

Los ratones fueron NI con PBS, SHe-PspA sola, cCHP-[SHe-PspA] o cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP (cdAMP, 10 µg; Yamasa Corporation, Chiba, Japón) una vez por semana durante 3 semanas consecutivas y luego se reforzó dos veces más a intervalos de 2 semanas (10 μg de proteína SHe-PspA por inmunización). Otros ratones fueron iPI con SHe-PspA más adyuvante incompleto de Freund (IFA, 100 µL; BD Difco, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.) o SHe-PspA solo tres veces una vez cada 3 semanas (Tabla 1 y Fig. 2a). Se recogieron suero, lavado nasal y BALF 1 semana después de la inmunización final. Se obtuvieron muestras de sangre de la vena submandibular de ratones86. Para recolectar las muestras de lavado nasal, se lavó un total de 100 µl de PBS estéril a través de la cavidad nasal anterior pipeteando con alícuotas de 4 µl de PBS. BALF se recogió instilando 1 ml de PBS estéril a través de una aguja roma colocada en la tráquea.

Para la inmunización, los ratones fueron anestesiados por vía intraperitoneal con una mezcla de medetomidina, midazolam y butorfanol (MMB)87,88. Brevemente, se utilizaron clorhidrato de medetomidina (Domitor®, ZENOAQ, Koriyama, Japón), midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma Inc., Tokio, Japón) y butorfanol (Vetorphale®, Meiji Seika Pharma Co., Ltd., Tokio, Japón). como agentes anestésicos de MMB. Se mezclaron y diluyeron medetomidina, midazolam y butorfanol con solución salina (Otsuka Normal Saline®, Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc., Tokushima, Japón) a concentraciones de 0,06, 0,8 y 1,0 mg/ml, respectivamente. Luego, se administró MMB a un volumen de dosificación de 5 ml/kg.

Las ratas algodoneras recibieron PBS, cCHP-[SHe-PspA] o cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP (5 µg; Ajinomoto, Tokio, Japón) una vez por semana durante 3 semanas consecutivas y luego se reforzaron dos veces más a las 2 Intervalos de una semana (100 μg de proteína SHe-PspA por inmunización). Otros grupos de ratas algodoneras fueron iPI con SHe-PspA más IFA (200 µL; BD Difco) tres veces una vez cada 3 semanas (Tabla 2 y Fig. 7a). Se recogieron suero y lavado nasal 1 semana después de la inmunización final. Se obtuvieron muestras de sangre de la vena lateral de la cola de ratas algodoneras. Para recolectar las muestras de lavado nasal, se lavó un total de 100 µl de PBS estéril a través de la cavidad nasal anterior pipeteando con alícuotas de 10 µl de PBS. Para la inmunización, se sacrificaron ratas algodoneras con una concentración de isoflurano del 3 al 4% (Muromachi Kikai Co., Ltd.).

Una semana después de la inmunización final, los ratones fueron expuestos por vía intratraqueal a 1 × 106 UFP de RSV suspendidos en 50 µL de PBS para evaluar la eficacia de la vacuna en el tracto respiratorio inferior, y otros ratones fueron expuestos por vía intranasal a 1 × 105 UFP de RSV suspendidos en 12 µL. de PBS para evaluar la eficacia de la vacuna en el tracto respiratorio superior bajo anestesia con MMB descrito como anteriormente. Cuatro días después de la infección, se sacrificó a los ratones y se recolectaron y evaluaron los pulmones y los compartimentos nasales para determinar su carga viral (Figura complementaria 2a).

Una semana después de la inmunización final, se recogieron lavados nasales de ratones inmunizados. Las muestras del lavado nasal (7 µl/muestra) se diluyeron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) sin suero y luego se incubaron con 1,0 x 105 UFP de RSV durante 30 minutos a 37 °C en un volumen final de exposición nasal de 12 µl. por ratón. Después de la incubación, se administró RSV por vía intranasal a ratones BALB/c sin tratamiento previo como se describe anteriormente (Figura complementaria 4).

Una semana después de la inmunización final, las ratas algodoneras fueron expuestas por vía intranasal a 3 × 105 PFU de RSV suspendido en 100 µl de PBS bajo anestesia con una concentración de isoflurano del 3 al 4% descrita anteriormente para evaluar la eficacia de la vacuna en los tractos respiratorios superior e inferior. Cuatro días después de la infección, se sacrificaron las ratas algodoneras y se recolectaron y evaluaron los pulmones y los compartimentos nasales para determinar su carga viral (Figura complementaria 2b).

Los títulos de anticuerpos anti-SHe IgG o IgA de ratones y ratas algodoneras inmunizados se determinaron mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas23. Se prepararon muestras de suero, lavado nasal y BALF en diluciones seriadas dobles y se cargaron en una placa de 96 micropocillos (NUNC MAXISORP IMMUNO; Thermo Fisher Scientific) recubierta con 1 μg/ml de SHe recombinante conjugado con albúmina sérica bovina (BSA). ). La síntesis de los péptidos SHe y BSA-SHe para este ensayo fue realizada en nuestro nombre por Eurofins Genomics KK (Tokio, Japón). Los péptidos SHe se sintetizaron utilizando la síntesis de péptidos en fase sólida de fluorenil-metoxi-carbonilo (Fmoc)89 y luego se conjugaron químicamente con BSA. La secuencia del péptido diana era NH2-C+NKLSEYNVFHNKTFELPRARVNT-COOH. IgG anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (1:4000; #1030-05, SouthernBiotech, Birmingham, AL, EE. UU.), IgA anti-ratón de cabra (1:4000; #1040-05, SouthernBiotech), IgA anti-rata de cabra Se utilizaron como anticuerpos secundarios IgG (1:4000; n.° 3030-05, SouthernBiotech) e IgA anti-rata de cabra (1:40.000; n.° 97185, Abcam, Cambridge, Reino Unido). Las reacciones se visualizaron utilizando el sistema de sustrato de peroxidasa de micropocillos TMB (XPL, Gaithersburg, MD, EE. UU.). El título de criterio de valoración se expresó como el log2 recíproco de la última dilución que dio una DO450 que era 0,1 unidades mayor que la del control negativo.

Para el ensayo de inmunoplaca, se homogeneizaron los pulmones totales y los compartimentos nasales, y se incubaron diluciones seriadas del sobrenadante en una placa de 24 pocillos (Corning, NY, EE. UU.) con monocapas de células HEp-2 en DMEM y se cubrieron con metilcelulosa al 3,0%, como descrito anteriormente40,90. Después de 3 días, las placas virales se visualizaron utilizando un anticuerpo policlonal de cabra anti-RSV (1:200; #AB1128, Millipore, Billerica, MA, EE. UU.) y un anticuerpo secundario IgG (H+L) de conejo anti-cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante ( 1:100; #61-1620, Thermo Fisher Scientific)40. Se contaron las placas visualizadas finales y se calculó el número de placas por gramo de tejido (UFP/g de tejido).

La actividad de neutralización del virus del suero de ratón y del lavado nasal se analizó mediante un ensayo de reducción de placas utilizando palivizumab (Synagis; AbbVie Inc. North Chicago, IL, EE. UU.), un anticuerpo monoclonal anti-RSV, como control positivo. Se diluyó suero o lavado nasal de ratones inmunizados en DMEM sin suero y se incubaron con aproximadamente 400 UFP o 25 UFP de RSV, respectivamente, durante 30 minutos a 37 °C en un volumen final de 1,5 ml. Luego, estas muestras se usaron para infectar una capa celular confluente de células HEp-2 cultivadas en una placa de 24 pocillos (Corning) en DMEM y recubiertas con metilcelulosa al 3,0 %40. El día 3, se llevó a cabo el ensayo de reducción de placas con el anticuerpo anti-RSV, como se describió anteriormente.

Se prepararon muestras de pulmón y cavidad nasal para microscopía confocal como se describió anteriormente91. Brevemente, las muestras se fijaron en paraformaldehído al 4% (peso/vol) en PBS durante la noche a 4 °C con balanceo, seguido de remojo en sacarosa al 20% (peso/vol) en PBS durante la noche a 4 °C con balanceo. Luego, las muestras se incluyeron en medio Super Cryoembedding Medium (Leica Microsystems KK, Wetzlar, Alemania). Para la tinción por inmunofluorescencia, se prepararon secciones congeladas de 10 μm de espesor utilizando un sistema de transferencia de cinta CryoJane (Instrumedics, St. Louis, MO, EE. UU.) y dejando que las secciones se secaran al aire. El RSV en las secciones se detectó utilizando un anticuerpo policlonal anti-RSV de cabra (1:480; #AB1128, Millipore, Billerica, MA, EE. UU.) y una IgG anti-cabra de burro (H+L) (1:400; # 705-166-147, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EE. UU.). Las secciones de la cavidad nasal se tiñeron adicionalmente para detectar el filamento de actina con el reactivo Phalloidin-iFluro647 (1:1000; n.º 176759, Abcam). Después del lavado, las muestras se montaron en ProLong Glass Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific) con DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU.) y se analizaron utilizando un microscopio de escaneo láser confocal DM-IRE2 (Leica Microsystems KK).

El ARN total se aisló de todo el pulmón o del compartimento nasal utilizando el reactivo Trizol (Thermo Fisher Scientific). Después de la purificación, el ARN se trató con ADNasa y se transcribieron de forma inversa 0,5 μg de ARN en ADNc utilizando PrimeScript RT master Mix (Takara Bio Inc.). La PCR cuantitativa se realizó por triplicado utilizando la mezcla maestra de PCR verde SYBR (Thermo Fisher Scientific) y un sistema de PCR en tiempo real StepOne (Thermo Fisher Scientific). Los cebadores específicos (Hokkaido System Science, Co., Ltd., Sapporo, Japón) utilizados para la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa en tiempo real (RT-PCR) fueron los siguientes: Rsv-f (adelante [F], 5′ -aatgatatgcctataacaaaatgatcagaa-3′; reverso [R], 5′-tggacatgatagagtaactttgctgtct-3′); Rsv-g (F, 5′-ccaaacaaacccaataatgattt-3′; R, 5′-gcccagcaggttggattgt-3′); Il4 (F, 5′-aagaacaccacagagagtgagctc-3′; R, 5′-tttcagtgatgtggacttggactc-3′); Il5 (F, 5′-ctctgttgacaagcaatgagacg-3'; R, 5′-tcttcagtatgtctagcccctg-3'); Il13 (F, 5′-cctggctcttgcttgcctt-3′; R, 5′-ggtcttgtgtgatgttgctca-3′); Gapdh (F, 5′-tgacctcaactacatggtctaca-3'; R, 5′-cttcccattctcggccttg-3'); Actb (F, 5′-ggctgtattcccctccatcg-3′; R, 5′-ccagttggtaacaatgccatgt-3′). Gapdh y Actb se utilizaron como múltiples genes de control interno para la normalización de datos de RT-PCR en tiempo real.

Los cambios en la expresión de la transcripción se calcularon comparando la expresión génica en muestras de pulmón completo o del compartimento nasal en cada grupo de inmunización, con el nivel en el tejido respectivo de ratones NI con cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP asignado a un valor de 1. .

Una semana después de la inmunización final, se recogieron los pulmones, los ganglios linfáticos cervicales y el bazo de cada ratón triturado en medio RPMI completo y se pasaron a través de un colador celular (malla, 70 µm). Después de centrifugar a 500 × g durante 6 minutos a 4 ° C, las células T CD90.2 + se purificaron utilizando un sistema de separación MACS (CD90.2 MicroBeads, ratón, Miltenyi Biotec, Renania del Norte-Westfalia, Alemania). Luego, se determinó el número de células T productoras de IFNγ o granzima B específicas de SHe mediante el uso de un ensayo de inmunopunción ligado a enzimas (ELISPOT). Brevemente, se recubrieron placas de 96 micropocillos (MultiScreen; Merck, Darmstadt, Alemania) con IFNγ anti-ratón de 5 μg/mL (#551216, clon R4-6A2, BD Biosciences, NJ, EE. UU.) o anti-IFNγ de 5 μg/mL -ratón Granzyme B (#AF1865, R&D Systems, MN, EE. UU.) durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron 3 veces con PBS y se bloquearon con medio completo durante 1 h a 37 °C. Luego, las células T de cada muestra se cultivaron en la placa precapturada junto con las células presentadoras de antígeno SHe, SHe conjugada con albúmina sérica bovina (SHe-BSA-) o SHe-PspA de la célula T. -población de esplenocitos agotada (1,0 × 105/pocillo) a 37 °C durante 72 h con 5 % de CO2. Para obtener esplenocitos empobrecidos en células T, se purificaron esplenocitos CD90.2- de ratones BALB/c vírgenes utilizando el sistema de separación MACS para separar las células T de las otras poblaciones esplénicas. Se utilizó IFN-γ anti-ratón de rata conjugado con biotina (2 µg/mL; #554410, clon XMG1.2, BD Biosciences) o Granzima B anti-ratón de cabra (1 µg/mL; #BAF1865, R&D Systems) como anticuerpo secundario. Las manchas se desarrollaron mediante incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente con 3-amino-9-etilcarbazol (Merck) en tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,0, que contenía H2O2 al 0,05%.

FI-RSV se preparó como se describió anteriormente92,93 con una ligera modificación. En resumen, el RSV A2 se inactivó con formalina (1:4000) durante 72 h a 37 °C. Luego, el RSV tratado con formalina se resuspendió en medio libre de suero y se confirmó la inactivación de FI-RSV mediante ensayo de inmunoplaca en células HEp-2.

Se creó un modelo de FI-RSV VED como se describió anteriormente40. En resumen, los ratones BALB/c se sometieron a sensibilización primaria con FI-RSV (equivalente a 105 PFU/ratón) e Imject Alum (Thermo Fisher Scientific) mediante inyección subcutánea. Tres semanas después, los ratones fueron sensibilizados con FI-RSV (105 UFP equivalente/ratón) mediante administración intranasal tres veces en días alternos, seguido de una infección final con RSV vivo (106 UFP/ratón) mediante instilación intratraqueal (Figura complementaria 6). ).

Se obtuvieron muestras de BALF de ratones inmunizados con PBS, cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP o FI-RSV VED el día 8 después de la exposición al RSV, y se incubaron aproximadamente 2 x 106 células de las suspensiones de células BALF recolectadas durante 10 minutos con Agente bloqueador del receptor Fc (1:50; #553142, BD Biosciences) para prevenir la unión no específica. A continuación, las suspensiones de células BALF recolectadas se tiñeron con anti-Siglec F (1:160; n.° 63-1702-80, Thermo Fisher Scientific) y anti-CD11b (1:160; n.° 69-0112-80, Thermo Fisher Scientific) anticuerpos, y luego se incubaron durante 30 minutos en la oscuridad a 4 ° C. Los datos se adquirieron en un citómetro de flujo Attune NxT (Thermo Fisher Scientific) y se analizaron utilizando el paquete de software FlowJo (TreeStar, Ashland, OR, EE. UU.) (Fig. 6b).

Se fijaron muestras de pulmón de ratones individuales en paraformaldehído al 4% (peso/vol) en PBS, se incluyeron en bloques de parafina (Fujifilm Wako Chemicals) y se seccionaron en un espesor de 5 µm. Luego, las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina para evaluar los cambios histopatológicos pulmonares y la infiltración de eosinófilos, respectivamente, como se describió anteriormente94.

El RSV se conjugó con Dynabeads Intact Virus Enrichment (n.º 10700D, Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante de tal manera que el RSV fuera de 1,0 × 107 UFP por 1 µl de perlas. Luego, las perlas RSV se incubaron con 70 µl de lavado nasal de ratones inmunizados durante 0,5 h a temperatura ambiente, seguido de tinción con IgG anti-ratón conjugada con FITC (1:100; #115-096-062, Jackson ImmunoResearch) o IgA anti-ratón conjugada con biotina (1:1000; # 1040-08, SouthernBiotech) y aloficocianina-estreptavidina (1: 1000; # 20-4317-U100, Tonbo Biosciences, San Diego, CA, EE. UU.). La unión del anticuerpo se evaluó midiendo la intensidad del marcaje fluorescente mediante citometría de flujo, y la intensidad fluorescente media de cada grupo se midió y expresó con el valor de RSV-Beads solo establecido en 1. El análisis por citometría de flujo se realizó utilizando un flujo Attune NxT. citómetro y todos los datos se analizaron utilizando el paquete de software FlowJo (Figura complementaria 3).

Solo cuando fue necesario, se sacrificaron ratones y ratas algodoneras mediante decapitación, bajo anestesia con una concentración de isoflurano del 5% o más (Muromachi Kikai Co., Ltd.), para la recolección de muestras.

Las comparaciones entre grupos se realizaron mediante la prueba t de Student de dos colas (para análisis de 2 grupos) y un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con la prueba de comparación múltiple de Tukey (para análisis de grupos múltiples). Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism versión 9.0 (GraphPad Software, San Diego, CA). Los valores de p inferiores a 0,05 se consideraron significativos.

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las Directrices para el uso y cuidado de animales de experimentación del Instituto de Ciencias Médicas de la Universidad de Tokio, Japón, y el protocolo fue aprobado por el Comité de Uso y Cuidado de Animales del instituto (aprobación #PH3-33 para ratones y #PA21-12 para ratas algodoneras).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Los datos complementarios subyacentes a las Figs. 1b, 2b–e, 3a–d, 4a–e, 5a–c, 6a, cy 7b–e y las figuras complementarias 1a–f y 5a, b se proporcionan como un archivo de datos de origen.

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Esta investigación fue apoyada por la Subvención para Investigación Científica S de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) (18H05280 a HK); Subvención JSPS para investigación científica B (20H03856 a KF); Subvención JSPS para investigación científica C (22K07942 a DT); Subvención JSPS para investigación científica que desafía la investigación pionera (20K20495 a KF); Fondo JSPS para la Promoción de la Investigación Internacional Conjunta (18KK0432 a YK); Fondo JSPS para la Promoción de la Investigación Internacional Conjunta (17KK0196 a DT); Agencia Japonesa de Investigación y Desarrollo Médico (AMED) (JP21am0401029 a HK y 223fa627003h0001 a RN-O, YK, KF y HK); Proyecto AMED centrado en el desarrollo de tecnología clave para descubrir y fabricar medicamentos para el tratamiento y diagnóstico de próxima generación (NeDDTrim) (JP21ae0121040 a HK); Fondo de Medicina Futura de la Universidad de Chiba (a YK); el Centro de Inmunología, Alergia y Vacunas de las Mucosas de la Universidad de Chiba-UC San Diego (a YK, PE y HK); subvención NIDDK P30 DK120515 (a PE y HK); Centro Internacional Conjunto de Uso/Investigación, el Instituto de Ciencias Médicas, la Universidad de Tokio (K22-3045 a PE, YK, HK y KF); la Fundación Científica Yamada (a YK); y una donación de 3M (a HK). Los patrocinadores no tenían control sobre la interpretación, redacción o publicación de este trabajo. Agradecemos a todo el personal de nuestro laboratorio por su apoyo técnico y discusiones.

División de Inmunología de las Mucosas, Unidad de Profesores Distinguidos del IMSUT, Instituto de Ciencias Médicas, Universidad de Tokio, Tokio, Japón

Shingo Umemoto, Rika Nakahashi-Ouchida, Yosuke Kurashima y Hiroshi Kiyono

Departamento de Otorrinolaringología y Cirugía de Cabeza y Cuello, Facultad de Medicina, Universidad de Oita, Oita, Japón

Shingo Umemoto, Takashi Hirano y Masashi Suzuki

Universidad de Chiba-Universidad de California Centro de Inmunología, Alergia y Vacunas de las Mucosas de San Diego (CU-UCSD cMAV), Departamento de Medicina, Facultad de Medicina, San Diego, CA, EE. UU.

Shingo Umemoto, Yosuke Kurashima, Daisuke Tokuhara, Peter B. Ernst y Hiroshi Kiyono

División de Vacunas Mucosas, Centro Internacional de Investigación y Desarrollo de Vacunas Mucosas, Instituto de Ciencias Médicas, Universidad de Tokio, Tokio, Japón

Rika Nakahashi-Ouchida, Yoshikazu Yuki, Shiho Kurokawa, Tomonori Machita, Yohei Uchida, Hiromi Mori y Tomoyuki Yamanoue

Departamento de Vacunación de las Mucosas Humanas, Hospital Universitario de Chiba, Chiba, Japón

Rika Nakahashi-Ouchida, Yoshikazu Yuki, Shiho Kurokawa, Tomonori Machita, Yohei Uchida, Hiromi Mori, Tomoyuki Yamanoue, Kohtaro Fujihashi, Yosuke Kurashima y Hiroshi Kiyono

Instituto de Sinergia de la Universidad de Chiba para la Investigación y el Desarrollo de Vacunas Mucosas Futuristas, Universidad de Chiba, Chiba, Japón

Rika Nakahashi-Ouchida, Kohtaro Fujihashi, Yosuke Kurashima y Hiroshi Kiyono

HanaVax Inc, Tokio, Japón

Yoshikazu Yuki y Hiroshi Kiyono

Departamento de Microbiología, Universidad Médica de Tokio, Tokio, Japón

Takehiko Shibata

Departamento de Inmunología, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, Tokio, Japón

Takehiko Shibata

Departamento de Química de Polímeros, Escuela de Graduados en Ingeniería, Universidad de Kyoto, Kyoto, Japón

Shin-ichi Sawada y Kazunari Akiyoshi

División de Bioquímicos, Yamasa Corporation, Chiba, Japón

Ishige Kazuya

División de Vacunas Mucosas, Centro Internacional de Diseño de Vacunas, Instituto de Ciencias Médicas, Universidad de Tokio, Tokio, Japón

Kohtaro Fujihashi y Yosuke Kurashima

Departamento de Odontología Pediátrica, Universidad de Alabama en Birmingham, Birmingham, AL, EE. UU.

Kohtaro Fujihashi

Instituto de Investigación Académica Avanzada, Universidad de Chiba, Chiba, Japón

Yosuke Kurashima

Departamento de Medicina Innovadora, Escuela de Graduados en Medicina, Universidad de Chiba, Chiba, Japón

Yosuke Kurashima

Departamento de Pediatría, Universidad Médica de Wakayama, Wakayama, Japón

Daisuke Tokuhara

División de Medicina y Patología Comparada, Departamento de Patología, Universidad de California, San Diego, CA, EE. UU.

Peter B Ernst

Centro de Ciencias Veterinarias y Medicina Comparada, Universidad de California, San Diego, CA, EE. UU.

Peter B Ernst

Organización de Investigación y Educación en Medicina del Futuro, Universidad de Chiba, Chiba, Japón

Peter B. Ernst y Hiroshi Kiyono

Inmunología de las mucosas y terapéutica de las alergias, Instituto de Investigación Destacada Mundial, Universidad de Chiba, Chiba, Japón

Hiroshi Kiyono

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SU, RN-O. e YY fueron responsables de la conceptualización del estudio. SU, SK, TM, YU, HM, TY, TS, SI.S., KI, TH y DT fueron responsables de crear los métodos de estudio y realizar las investigaciones. SU fue responsable de realizar los análisis estadísticos. SU, RN-O., YY y HK fueron responsables de escribir el manuscrito. KF, KA, YK, DT, PE, MS y HK fueron responsables de revisar y editar el manuscrito. RN-O., YY, YK, KF y HK fueron responsables de la adquisición de fondos.

Correspondencia a Hiroshi Kiyono.

YY y HK son directores y fundadores de HanaVax Inc. RN-O., SI.S. y KA son asesores científicos de HanaVax Inc. Los autores restantes no declaran tener intereses en competencia.

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Umemoto, S., Nakahashi-Ouchida, R., Yuki, Y. et al. La vacuna nasal de nanogel catiónico que contiene el ectodominio de la proteína hidrofóbica pequeña del RSV induce inmunidad protectora en roedores. npj Vacunas 8, 106 (2023). https://doi.org/10.1038/s41541-023-00700-3

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Recibido: 21 de enero de 2023

Aceptado: 22 de junio de 2023

Publicado: 24 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41541-023-00700-3

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