Blog

Jul 30, 2023

Biosíntesis de ansamitocina P.

Communications Biology volumen 6, Número de artículo: 860 (2023) Citar este artículo 336 Accesos 1 Altmetric Detalles de métricas Los productos naturales bioactivos microbianos median funciones ecológicamente beneficiosas para

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 860 (2023) Citar este artículo

336 Accesos

1 altmétrica

Detalles de métricas

Los productos naturales bioactivos microbianos median funciones ecológicamente beneficiosas para las cepas productoras y se han utilizado ampliamente en la clínica y la agricultura con objetivos y mecanismos subyacentes claramente definidos. Sin embargo, los efectos fisiológicos de su biosíntesis en las cepas productoras siguen siendo en gran medida desconocidos. Se descubrió que la ansamitocina P-3 (AP-3) antitumoral, producida por Actinosynnema pretiosum ATCC 31280, reprime el crecimiento de la cepa productora en altas concentraciones y se dirige a la proteína FtsZ involucrada en la división celular. Trabajos anteriores sugirieron la presencia de objetivos crípticos adicionales de AP-3 en ATCC 31280. Aquí utilizamos un enfoque quimioproteómico con una sonda de fotoafinidad derivada de AP-3 para perfilar las interacciones de AP-3 en todo el proteoma. AP-3 exhibe uniones específicas a la desoxitimidina difosfato glucosa-4,6-deshidratasa, aldehído deshidrogenasa y timidilato sintasa dependiente de flavina, aparentemente no relacionadas, que participan en el ensamblaje de la pared celular, el metabolismo central del carbono y la biosíntesis de nucleótidos, respectivamente. AP-3 funciona como un inhibidor no competitivo de las tres proteínas objetivo mencionadas anteriormente, generando estrés fisiológico en la cepa productora al interferir diversas vías metabólicas. La sobreexpresión de estas proteínas diana aumenta la biomasa de la cepa y aumenta notablemente los títulos de AP-3. Este hallazgo demuestra que la identificación y la ingeniería de objetivos crípticos de productos naturales bioactivos pueden conducir a una comprensión profunda de la fisiología microbiana y a mejores títulos de productos.

Los microbios, ejemplificados por las actinobacterias y los hongos, son un rico repertorio de productos naturales con diversas estructuras y bioactividades, que se utilizan como agentes antibacterianos, antifúngicos, antitumorales, inmunosupresores, reductores del colesterol, etc. Debido a las amplias aplicaciones de los productos microbianos naturales en la clínica y la agricultura, sus modos de acción y componentes celulares específicos se han caracterizado bien en diversos patógenos y tejidos infectados. Por ejemplo, la penicilina antibacteriana se dirige a las transpeptidasas, que pertenecen a las proteínas transportadoras de penicilina (PBP), e inhibe la biosíntesis de peptidoglicano en las bacterias2; El inmunosupresor rapamicina se une a la proteína de unión FK506 humana FKBP12 y, posteriormente, el complejo binario formado inhibe el objetivo de la proteína rapamicina (TOR) para ejercer el efecto inmunosupresor3.

Curiosamente, debido al desarrollo de la tecnología quimioproteómica que utiliza sondas químicas derivadas de fármacos, se han identificado más proteínas de unión a fármacos implicadas en múltiples vías fisiológicas, lo que implica funciones biológicas adicionales de un fármaco designado4. Utilizando derivados sintéticos de β-lactámicos con diferentes sustituciones de cadenas laterales como sondas para el marcaje in vivo, Staub y Sieber identificaron no solo las PBP conocidas, sino también objetivos bacterianos no PBP, incluido el factor de virulencia ClpP y una β-lactamasa relacionada con la resistencia5. Recientemente, Sun et al. identificaron STAT3 como un nuevo objetivo de la rapamicina y su supresión del crecimiento tumoral, utilizando un análogo fotoactivo de la rapamicina6.

Sin embargo, los efectos de la producción de productos naturales sobre sus anfitriones productores han sido poco explorados. Los objetivos celulares de algunos antiinfecciosos se dedujeron en gran medida de las proteínas diana conocidas en los patógenos, y se caracterizaron los mecanismos de resistencia correspondientes en las cepas productoras7. El objetivo de la rifamicina antituberculosa es la subunidad β de la ARN polimerasa bacteriana8, cuya contraparte con mutaciones N447, D438 y Q432 se identificó en la cepa Amycolatopsis mediterranei S699 productora de rifamicina; y estos mutantes confieren autoprotección al huésped9. De manera similar, se encontró que un gen designado 23S rRNA N-metiltransferasa lmrB estaba presente en el grupo de genes biosintéticos de lincomicina de Streptomyces lincolnensis para proporcionar resistencia a la lincomicina suplementada10.

Las ansamitocinas (Fig. 1a) son maitansinoides producidos por actinobacterias con extraordinaria potencia antitumoral; se dirigen específicamente a los microtúbulos y han servido como "ojivas" en inmunoconjugados para el tratamiento de varios tipos de cánceres de mama metastásicos. Las ansamitocinas son producidas por Actinosynnema, Amycolatopsis y Nocardiopsis, entre las cuales los miembros del género Actinosynnema se utilizan principalmente para la fermentación industrial de ansamitocinas11,12,13. Recientemente, descubrimos que la ansamitocina P-3 (AP-3) en una concentración alta suprimió el crecimiento de la cepa productora, Actinosynnema pretiosum ATCC 31280 (en adelante, ATCC 31280) (Tabla complementaria 1), al atacar la proteína de división celular FtsZ. una proteína similar a la tubulina β en las bacterias. La sobreexpresión del gen que codifica FtsZ obviamente mejoró la resistencia de la cepa recombinante a AP-3, como lo demuestra un mejor crecimiento que la cepa inicial en presencia de 300 mg/l de AP-3. Sin embargo, el crecimiento de la cepa recombinante todavía sufrió una biomasa inferior en presencia de AP-3 exógeno, lo que sugiere que FtsZ podría no ser el único objetivo de AP-314. Por lo tanto, propusimos que otras dianas crípticas de AP-3 podrían estar presentes en la cepa productora, y la identificación de estas dianas sería crucial para comprender el estrés causado por la biosíntesis de AP-3 y luego mejorar aún más el título de AP-3. .

a Estructura química de AP-3. La numeración de las claves está etiquetada en la estructura. b Perfiles de crecimiento de ATCC 31280 de tipo salvaje y HQG-3 mutante nulo de AP-3 en medio YMS. La discrepancia del peso de las células secas entre ATCC 31280 y HQG-3 se muestra como números porcentuales. Los datos se presentan como valores medios ± DE de tres experimentos independientes. Los valores de p se calcularon utilizando una prueba t de Student de dos colas suponiendo una varianza desigual; *P < 0,1; **P < 0,05; ***P<0,01. c Micelio de la cepa ATCC 31280 en fase estacionaria que muestra bastones cortos después de la fragmentación. d Micelia ramificada y parcialmente fracturada de HQG-3 en fase estacionaria. La longitud total de la barra de escala de la imagen SEM es de 5 μm.

Por lo tanto, utilizamos una sonda derivada de AP-3 de fotoafinidad específica, combinada con análisis cuantitativo basado en espectrometría de masas (MS), para detectar los objetivos crípticos de AP-3 en la cepa productora ATCC 31280. Nuestros análisis revelaron que la biosíntesis de AP-3 3 interfirió la fisiología de ATCC 31280 de una manera de múltiples objetivos, con desoxitimidina difosfato glucosa-4,6 deshidratasa (dTGD), aldehído deshidrogenasa (ALDH) y timidilato sintasa dependiente de flavina (FDTS) como objetivos AP-3. Las cepas recombinantes que sobreexpresaron estas proteínas exhibieron una mayor biomasa bajo la exposición a AP-3 y también títulos notablemente más altos de AP-3.

Para explorar la capacidad potencial de AP-3 (Fig. 1a) para causar perturbaciones fisiológicas de la cepa productora, interrumpimos todo el grupo de genes biosintéticos de ansamitocina (grupo ansa) mediante recombinación doble cruzada en la cepa ATCC 31280 utilizando el plásmido derivado de pJTU1278 ( Tabla complementaria 2). Esto se logró mediante la clonación de secuencias flanqueantes aguas arriba y aguas abajo amplificadas por PCR con dos pares de cebadores designados (Tabla complementaria 3), generando la cepa recombinante HQG-3 como cepa de referencia (Figura 1 complementaria). El crecimiento de las dos cepas se comparó en medio YMS (Tabla complementaria 4), y los resultados demostraron que la biomasa de HQG-3 era superior a la de la cepa ATCC 31280. Las diferencias en la biomasa aumentaron gradualmente durante el crecimiento exponencial, de modo que el La biomasa de HQG-3 fue un 22% mayor que la de la cepa de tipo salvaje en el cuarto día de fermentación (Fig. 1b), probablemente debido a la ausencia de producción de AP-3 en HQG-3. Las observaciones sobre la morfología del micelio en fase estacionaria mediante microscopía electrónica de barrido revelaron que la cepa ATCC 31280 tenía una morfología de bastones cortos después de la fragmentación, mientras que los micelios de HQG-3 estaban ramificados y parcialmente fracturados (Fig. 1c, d). Estos resultados sugirieron que la biosíntesis de AP-3 en su baja concentración también provoca estrés fisiológico, provocando un crecimiento inferior de la cepa productora.

Para identificar posibles objetivos de unión de AP-3 dentro de la cepa ATCC 31280, diseñamos una sonda quimioproteómica específica y realizamos un análisis cuantitativo basado en EM. Según la relación estructura-actividad de AP-3, la metilación en C20 tiene una contribución insignificante a su actividad biológica13. En consecuencia, razonamos que este grupo metilo podría reemplazarse por un resto diazirina-alquino (YNE) para generar una sonda. Por lo tanto, interrumpimos el gen asm716 que codifica la metiltransferasa en la cepa ATCC 31280 para generar HQG-1 mutante (Figuras complementarias 2a, b), que acumuló 20-desmetil-ansamitocina P-3 (QG-1), según lo determinado por cromatografía líquida. Análisis (LC) -MS (Figuras complementarias 2c-f). El resto YNE se instaló en el grupo hidroxilo fenólico en C20 de QG-1 mediante la aplicación de K2CO3 para generar la sonda de fotoafinidad QG-YNE (Fig. 2a). La estructura química del compuesto QG-YNE se confirmó mediante análisis de EM y resonancia magnética nuclear (Figuras complementarias 3 a 5). El análisis de bioactividad utilizando la levadura sensible a AP-3 Filobasidium uniguttulatum como cepa indicadora17 demostró que la sonda QG-YNE inhibió el crecimiento de la levadura a un nivel comparable al de AP-3 (Fig. 2b), lo que indica que la unión del resto YNE no interfirió con la potencia biológica de QG-YNE.

a Estructuras químicas de QG-1 y QG-YNE. b Comparación de las bioactividades de AP-3 y la sonda QG-YNE frente a una cepa indicadora de levadura. c Diagrama de Venn que muestra una superposición de 14 proteínas de unión a AP-3 en las fracciones de alta abundancia de tres ensayos quimioproteómicos con diferentes tiempos de exposición a los rayos UV. d Tolerancia de cepas recombinantes que sobreexpresan proteínas de unión a AP-3 a AP-3 exógena (200 mg/l). La discrepancia de biomasa entre ATCC 31280 y las cepas recombinantes se muestra como números porcentuales. Barras naranjas, biomasa superior a la del tipo salvaje; barras blancas, biomasa inferior a la del tipo salvaje; barra gris, tipo salvaje. *P < 0,1; **P < 0,05, ***P < 0,01. e Resistencia de HQG-7, HQG-13 y HGQ-17 a 400 mg/L de AP-3 exógeno.

Para identificar las proteínas de unión a AP-3, se preincubaron lisados ​​celulares de la cepa ATCC 31280 con QG-YNE durante 2 h y luego se irradiaron con luz ultravioleta. Después de una reacción de clic con perlas magnéticas de estreptavidina, llevamos a cabo manipulaciones desplegables para capturar y enriquecer proteínas unidas a QG-YNE. Las perlas se separaron de las proteínas mediante digestión tríptica in situ y luego las reacciones se marcaron con reactivos isobáricos de etiquetado de masas (TMT-126/127) que contenían informadores únicos (Figura complementaria 6). Finalmente, los fragmentos peptídicos se analizaron mediante EM y la información proteómica funcional obtenida se filtró mediante un factor >1 para la proporción de TMT-127/126.

Las proteínas recuperadas (fragmentos) se compararon con las proteínas anotadas de la cepa ATCC 31280, y a partir de tres estudios independientes de proteínas de unión a AP-3 utilizando tiempos de exposición a los rayos UV reducidos gradualmente, obtuvimos un enriquecimiento de 708, 490 y 83 candidatos, respectivamente. Los efectos de las diversas irradiaciones UV en los resultados individuales fueron reproducibles, y el análisis del diagrama de Venn reveló 14 proteínas de unión que eran comunes a los tres tiempos de exposición a los rayos UV (Fig. 2c). Además de la metiltransferasa Asm7, que metila el intermedio biosintético de ansamitocina, las otras 13 proteínas candidatas se asociaron con diversas vías metabólicas, incluido el metabolismo de aldehídos, la síntesis de la pared celular, la biosíntesis de ácidos nucleicos y las vías reguladoras (Tabla complementaria 5). Estos resultados sugirieron que el estrés sobre el crecimiento y los cambios morfológicos provocados por la biosíntesis de AP-3 podrían surgir a través de diferentes vías metabólicas.

Como la mayoría de las proteínas de unión a AP-3 participan en procesos metabólicos esenciales, como la división celular, el ensamblaje de la pared celular, la biosíntesis de nucleótidos y el metabolismo central del carbono, no fue posible utilizar la alteración genética para examinar sus posibles impactos en la cepa productora. Por lo tanto, diseñamos un conjunto de plásmidos de sobreexpresión integradores que contienen cada uno de los genes de la proteína de unión clonados bajo el control de un fuerte promotor constitutivo kasOp*18 (Figuras complementarias 7, 8). En este caso, Asm7 se excluyó ya que es responsable de la metilación en la posición C20 de AP-3, y APASM_6814 y APASM_6815 forman un casete genético para su coexpresión. Por lo tanto, solo se construyeron 12 plásmidos de sobreexpresión y se introdujeron por separado en la cepa ATCC 31280 (Tabla complementaria 2). Se evaluó la tolerancia de las cepas recombinantes resultantes a AP-3 suplementando los cultivos de fermentación con una concentración final de 200 mg/l de AP-3. Luego se evaluó la biomasa al quinto día, cuando los cultivos alcanzaron la fase estacionaria. Cepas HQG-7, HQG-13 y HQG-17, que sobreexpresaban aldehído deshidrogenasa (ALDH) (codificada por el gen APASM_1052), timidilato sintasa dependiente de flavina (FDTS) (codificada por el gen APASM_5765) y desoxitimidina difosfato glucosa-4,6 deshidratasa (dTGD) (codificado por el gen APASM_6307), respectivamente, mostró una mejor tolerancia a AP-3 que la cepa de tipo salvaje entre los 12 mutantes que portan plásmidos de sobreexpresión (Fig. 2d). Las cepas HQG-7, HQG-13 y HQG-17 se desafiaron adicionalmente utilizando una concentración más alta de AP-3 (400 mg/L), y el análisis cuantitativo de la biomasa en el quinto día de fermentación reveló un mejor crecimiento de estas cepas, con La tolerancia a AP-3 mejoró significativamente según lo determinado mediante el aumento de la biomasa en un 45%, 42% y 27%, respectivamente, en comparación con la de ATCC 31280 (Fig. 2e). Como se deduce de la anotación y de los estudios funcionales en otras bacterias sobre estas tres proteínas, la ALDH codificada por APASM_1052 cataliza la oxidación de aldehídos; El FDTS codificado con APASM_5765 participa en la síntesis de dTMP a partir de dUMP; y el dTGD codificado por APASM_6307 media la formación de dTDP-L-ramnosa involucrada en la síntesis de la pared y cápsula celular bacteriana (Figura complementaria 9) 19, lo que indica los diversos procesos metabólicos afectados por AP-3.

dTGD oxida el grupo hidroxilo C4 de D-glucosa con NAD(H) como cofactor, seguido de deshidratación, lo que da como resultado la generación del precursor dTDP-L-ramnosa dTDP-6-desoxi-D-xilo-4-hexulosa ( Figura complementaria 10). Diversos estudios genéticos han determinado que la anulación de la biosíntesis de dTDP-L-ramnosa atenúa en gran medida la virulencia, e incluso puede influir en la viabilidad, de algunas bacterias patógenas20. Para examinar la interacción entre AP-3 y dTGD, purificamos dTGD expresado heterólogamente de E. coli (Figura 11 complementaria) y utilizamos resonancia de plasmón superficial (SPR) para analizar la interacción de dTGD y AP-3 en concentraciones variadas. Se determinó que AP-3 se une a dTGD con una constante de afinidad KD de 3,60 × 10–4 M, que era similar a la KD para la interacción entre Asm7 de la vía biosintética AP-316 y AP-3 (Fig. 3a, Suplementario Tabla 6). El análisis de EM de los fragmentos peptídicos dTGD unidos a la sonda de fotoafinidad QG-YNE reveló que el péptido 314-DNRDWWEPLKQR-325 era el péptido incorporado específico, que tenía el aumento esperado de 712,31 Da (equivalente a QG-YNE con una pérdida de N2) en peso molecular, relativo al fragmento peptídico no modificado. Un análisis más detallado del espectro de MS secundario (MS2) indicó que el marcaje se ubicó en los grupos carboxilo de la cadena lateral de Arg325 y Gln324 de dTGD (Fig. 3b, Fig. 12 complementaria).

a La interacción entre AP-3 y dTGD fue detectada por SPR, dando un valor de KD de 3,60 × 10−4 M. b Espectro MS2 de un péptido modificado con QG-YNE de dTGD (314-DNRDWWEPLKQR-325 (Q324 + 712,31 Da ) (R+712,31 Da)). c Vista general del complejo de homomonómero AP-3 y dTGD. Las distancias (Å) entre los aminoácidos catalíticos conservados y AP-3 se indican mediante líneas discontinuas. Gris claro, homomonómero dTGD; azul cielo, AP-3; amarillo, péptido marcado por QG-YNE; naranja, aminoácido modificado por QG-YNE; violeta, aminoácido conservado de dTGD. d La cinética inhibidora de AP-3 con dTGD se muestra mediante gráficos recíprocos dobles obtenidos usando AP-3 0,31 o 0,63 mM o DMSO al 1% (v/v) (el control). Los datos se presentan como valores medios con barras de error que representan la DE de tres experimentos independientes. e Morfología micelial de la cepa ATCC 31280 (panel izquierdo) y HQG-17 (panel central) en el quinto día de fermentación. Panel derecho, comparación de longitudes de varillas miceliales. La discrepancia en la longitud del micelio entre ATCC 31280 y HQG-17 se muestra como números porcentuales. La longitud total de la barra de escala de la imagen SEM es de 5 μm. Los datos se presentan como valores medios con barras de error que representan la DE de cinco experimentos independientes; ***P<0,01.

Para obtener una comprensión completa de la interferencia de AP-3 con la capacidad catalítica de dTGD, se estableció la arquitectura molecular de dTGD con el servidor AlphaFold2. La alineación de la estructura flexible de proteínas homólogas y DesIV de Streptomyces venezuelae (entrada PDB 1r66) mostró que sus arquitecturas eran muy similares con un RMSD de 0,41 y la diada catalítica conservada de Asp128 y Glu129 (Figura complementaria 13). El análisis de acoplamiento molecular para AP-3 y dTGD sugirió que AP-3 se unía a la proteína objetivo con una afinidad de −5,96 kcal/mol, a través de enlaces de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas con residuos de aminoácidos adyacentes en la región de unión. El área de unión de AP-3 estaba alejada del sitio catalítico activo de dTGD, y las distancias entre el grupo hidroxilo en C20 de AP-3 y Asp128 y Glu129 de dTGD fueron 34,40 Å y 30,50 Å, respectivamente (Fig. 3c). El grupo hidroxilo en C20, que se modificó para generar la sonda de fotoafinidad QG-YNE, estaba cerca de los residuos Arg325 y Gln324 de dTGD, a una distancia apropiada para que el grupo de fotoafinidad se entrecruzara con los residuos, de acuerdo con el análisis de MS2 (Figura complementaria .14).

Además, realizamos un análisis cuantitativo de la actividad de dTGD utilizando diferentes concentraciones de dTDP-D-glucosa como sustrato y NAD+ como cofactor, según lo monitoreado por un lector de microplacas a 320 nm (A320) (Figura complementaria 15). En condiciones optimizadas, la kcat y la Km de dTGD se midieron como 43,29 min-1 y 0,15 mM, respectivamente. Los valores de kcat y Km también se determinaron en presencia de AP-3 0,31 mM como 34,46 min-1 y 0,17 mM, respectivamente, o en presencia de AP-3 0,63 mM como 29,38 min-1 y 0,18 mM, respectivamente (Fig. .3d). La constante inhibidora (KI) de AP-3 se calculó como 1,10 mM en función de las asociaciones entre los valores de Km y diferentes concentraciones de AP-3 (Tabla complementaria 7). Estos resultados sugirieron que AP-3 sirve como un inhibidor no competitivo de dTGD.

Como la alteración del gen que codifica la dTDP-D-glucosa 4,6-deshidratasa resultó en el alargamiento de las células hasta 40 veces en Proteus mirabilis21, comparamos la morfología micelial de las cepas ATCC 31280 y HQG-17. Curiosamente, la longitud promedio de una sola célula de HQG-17 fue aproximadamente 1,65 veces más larga que la de ATCC 31280 estadísticamente, como se observa mediante microscopía electrónica de barrido con cultivos en fase estacionaria (Fig. 3e), lo que sugiere que AP-3 podría inhibir dTDP-L- suministro de ramnosa en la cepa productora apuntando a dTGD.

La timidilato sintasa dependiente de flavina (FDTS) ejecuta un patrón de reacción de varios pasos, que cataliza la metilación reductora de 2′-desoxiuridina-5′-monofosfato (dUMP) a 2′-desoxitimidina-5′-monofosfato (dTMP). Durante el proceso de metilación, FDTS inicialmente cataliza la conversión de FAD en FADH2 con el consumo de dos equivalentes de NADPH, y luego transfiere un grupo metileno de 5,10-metilenetetrahidrofolato (mTHF) a dUMP para generar dTMP y 7,8-dihidrofolato. . Una vez que el mTHF está ausente en las reacciones en las condiciones existentes de O2, FDTS actúa como una NADPH oxidasa y cataliza FADH2 y dos equivalentes de NADP para producir FAD y H2O2 (Figura complementaria 16)22.

Para caracterizar la interacción entre FDTS y AP-3, se obtuvo FDTS recombinante mediante expresión heteróloga en E. coli (Figura complementaria 11). Según el análisis del biosensor SPR, se determinó que la constante de disociación KD de AP-3 con FDTS era 6,65 × 10 −5 M, lo que indica una alta afinidad de AP-3 por FDTS (Fig. 4a, Tabla complementaria 6). Para identificar los residuos críticos para la unión de AP-3, se digirió y analizó FDTS marcado con QG-YNE mediante LC-MS/MS. Se encontró que el péptido 90-HFSYSQLSQR-99 estaba modificado covalentemente y exhibía un aumento de masa de 712,31 (equivalente a QG-YNE con pérdida de N2) en comparación con el fragmento peptídico no modificado. La secuencia de aminoácidos se confirmó de forma inequívoca gracias a los numerosos iones de tipo b formados tras la fragmentación por disociación colisional de alta energía (HCD). Un análisis adicional del espectro MS2 localizó el etiquetado en el residuo Leu96 (Fig. 4b, Fig. 17 complementaria).

a SPR detectó la interacción entre AP-3 y FDTS, lo que arrojó un valor de KD de 6,65 × 10−5 M. b Espectro MS2 de un péptido modificado con QG-YNE de FDTS (90-HFSYSQLSQR-99 (L96 + 712,31 Da) ). c Vista general del complejo homotetrámero AP-3 y FDTS. Las distancias (Å) entre los aminoácidos conservados y AP-3 se indican mediante líneas discontinuas. Gris claro, homomonómero FDTS; azul cielo, AP-3; amarillo, péptido marcado por QG-YNE; naranja, aminoácido modificado por QG-YNE; violeta, aminoácidos conservados de FDTS. d La cinética inhibidora de AP-3 con FDTS se muestra mediante gráficos recíprocos dobles obtenidos usando AP-3 0,02 o 0,04 mM o DMSO al 1% (v/v) (el control). Los datos se presentan como valores medios con barras de error que representan la DE de tres experimentos independientes. e Concentraciones intracelulares de dTMP de las cepas ATCC 31280, HQG-3 o HQG-13 mediante análisis cuantitativo. La discrepancia se muestra como números porcentuales. **P<0,05.

Posteriormente, se simuló una estructura homotetrámera del FDTS con el servidor AlphaFold2. Las proteínas homólogas y ThyX de Thermotoga maritima (entrada PDB 7ndz) mostraron una alta similitud con un RMSD de 1,67 y Ser97 y Tyr99 altamente conservados en sitios activos (Figura complementaria 18). El análisis de acoplamiento molecular mostró que AP-3 se unía a una región vecina al bolsillo catalítico activo de FDTS con una afinidad de −6,76 kcal/mol. AP-3 se ancló en el complejo mediante enlaces de hidrógeno e interacciones hidrófobas con residuos amino clave. Las distancias entre el grupo hidroxilo en C20 de AP-3 y Ser97 y Tyr99 de FDTS fueron 11,70 Å y 12,40 Å, respectivamente (Fig. 4c). El grupo hidroxilo en C20 se cerró a Leu96 con una distancia de 3,80 Å, lo que facilitó el grupo de fotoafinidad conectado con Leu96 durante las irradiaciones UV (Figura complementaria 19).

La actividad NADPH oxidasa de FDTS se analizó con FAD como aceptor de H+ y en presencia de dUMP. Convenientemente, el NADPH fue detectable mediante absorción lineal a 340 nm en un rango de 0,015 a 1 mM (Figura complementaria 20). Se determinó que los valores de kcat y Km de FDTS para la reducción de NADPH eran 57,63 min-1 y 0,66 mM, respectivamente, monitoreando las reacciones con diferentes concentraciones de dUMP. Como la capacidad catalítica de FDTS fue inhibida por concentraciones de AP-3 superiores a 0,08 mM, las reacciones se complementaron con AP-3 en concentraciones finales de 0,02 o 0,04 mM. Los valores de kcat y Km se calcularon además como 42,88 min-1 y 0,65 mM en presencia de AP-3 0,02 mM, respectivamente, y 33,03 min-1 y 0,69 mM con AP-3 0,04 mM, respectivamente (Fig. 4d). Estos resultados mostraron que AP-3 era un represor no competitivo de FDTS, con un valor de KI de 0,05 mM (Tabla complementaria 8).

Para explorar más a fondo la contribución fisiológica de FDTS, medimos las concentraciones intracelulares de dTMP de las cepas ATCC 31280, HQG-3 y HQG-13. La concentración de dTMP en la cepa HQG-13 aumentó en un 14,3% y un 8,3% con respecto a los niveles de las cepas ATCC 31280 y HQG-3, respectivamente (Fig. 4e, Fig. 21 complementaria). Por lo tanto, la producción de AP-3 impide la actividad catalítica de FDTS y conduce a un suministro reducido de dTMP para la síntesis de ADN en la cepa productora.

Las ALDH participan comúnmente en la conversión de aldehídos, generados durante los procesos metabólicos celulares, en ácidos con la ayuda del cofactor NAD(P)+. La mayoría de los aldehídos son químicamente activos y fisiológicamente tóxicos para los organismos generadores, y los ALDH participan en la desintoxicación de los aldehídos y ayudan a mantener la reserva de equivalentes reductores23,24. Para caracterizar las interacciones entre ALDH y AP-3, purificamos ALDH soluble de los lisados ​​​​celulares de recombinantes de Escherichia coli BL21 (DE3) (Figura 11 complementaria), y la afinidad de AP-3 por ALDH se determinó mediante análisis de biosensor SPR. Se determinó que el valor de KD era 1,97 × 10−5 M para la interacción de AP-3 con ALDH (Fig. 5a, Tabla complementaria 6). Para identificar los residuos de ALDH unidos por AP-3, se fotomarcó ALDH recombinante con QG-YNE, se digirió con tripsina y se analizó mediante LC-MS/MS. El péptido 18-SRYDHFIGGEFTAPAK-33 mostró un aumento de masa de 712,31 (equivalente a QG-YNE con pérdida de N2), y el análisis del espectro MS2 de este péptido localizó el marcaje en Arg19 (Fig. 5b, Fig. Suplementaria 22).

a SPR detectó la interacción entre AP-3 y ALDH, con un valor de KD de 1,97 × 10−5 M. b Espectro MS2 de un péptido modificado con QG-YNE de ALDH (18-SRYDHFIGGEFTAPAK-33 (Arg19 + 712,31 Da) ). c Vista general del complejo de homomonómero AP-3 y ALDH. Las distancias (Å) entre los aminoácidos conservados y AP-3 se indican mediante líneas discontinuas. Gris claro, homomonómero dTGD que interactúa con AP-3; azul cielo, AP-3; amarillo, péptido marcado por QG-YNE; naranja, aminoácido modificado por QG-YNE; violeta, aminoácidos conservados de ALDH. d La cinética inhibidora de AP-3 con ALDH se muestra mediante gráficos recíprocos dobles obtenidos usando AP-3 0,31 o 0,63 mM o DMSO al 1% (v/v) (el control). Los datos se presentan como valores medios con barras de error que representan la DE de tres experimentos independientes. e Concentraciones intracelulares de acetil-CoA, ácido cítrico y ácido isocítrico de las cepas ATCC 31280, HQG-3 o HQG-7 mediante análisis cuantitativo. La discrepancia se muestra como números porcentuales. *P < 0,1; **P < 0,05; ***P<0,01.

Luego, se construyó una arquitectura homotetrámero de ALDH a través del servidor AlphaFold2. La comparación de proteínas homólogas y ALDH de mitocondrias bovinas (entrada PDB 1a4z) mostró una alta similitud con un RMSD de 0,82 y residuos clave Cys302 y Glu263 conservados en los sitios activos catalíticos (Figura complementaria 23). El análisis del complejo de acoplamiento molecular reveló que AP-3 se desvió del bolsillo catalítico activo de ALDH con una afinidad de −7,40 kcal/mol. Las distancias entre el grupo hidroxilo en C20 de AP-3 y Cys302 y Glu263 de ALDH fueron 38,40 Å y 40,50 Å, respectivamente (Fig. 5c). Se formaron interacciones de enlaces de hidrógeno entre el grupo carbonilo del resto acetilo en C3 y Arg17 y entre el grupo hidroxi en C9 y Arg17, con distancias de 3,30 Å y 2,80 Å, respectivamente. El anillo de macrolactama de AP-3 está unido a la bolsa de ALDH mediante interacciones hidrofóbicas. El grupo hidroxilo en C20 se acercó a Arg19 con una distancia de 4,20 Å, y dicha distancia permitió una conexión entre el grupo de fotoafinidad de la sonda QG-YNE con Arg19 de ALDH durante las irradiaciones UV (Figura complementaria 24).

Luego se establecieron las reacciones enzimáticas de ALDH con aldehído como sustrato y NAD+ como cofactor. Durante la transformación de aldehídos en ácidos mediante ALDH, se generó el NADH equivalente, que podría detectarse convenientemente mediante un ensayo cromogénico (Figura complementaria 25). Se determinaron los valores de kcat (8,40 min-1) y Km (0,10 mM) para la actividad catalítica de ALDH sobre aldehídos y luego se llevaron a cabo ensayos de interferencia de AP-3 con ALDH. Los valores de kcat y Km se calcularon como 5,48 min-1 y 0,07 mM, respectivamente, con 0,31 mM de AP-3 en las reacciones. Se detectaron valores de kcat y Km de 3,99 min-1 y 0,05 mM en presencia de AP-3 0,63 mM (Fig. 5d). Estos resultados sugirieron que AP-3 sirvió como inhibidor de ALDH, con un valor de inhibición de KI = 0,82 mM (Tabla complementaria 9).

Además, la sobreexpresión del gen que codifica ALDH en la cepa HQG-7 mejoró la acumulación de acetil-CoA intracelular en un 90 % con respecto a los niveles en la cepa ATCC 31280, y este aumento de acetil-CoA, en consecuencia, mejoró la acumulación de ácido isocítrico y ácido cítrico en un 118 % y 80%, respectivamente, en HQG-7 en comparación con la cepa ATCC 31280, impulsando el crecimiento de HQG-7 con sobreexpresión de ALDH. Además, también se midieron los niveles intracelulares de acetil-CoA, ácido cítrico y ácido isocítrico en la cepa HQG-3 con grupo ansa alterado y se encontró que aumentaban en un 34%, 8% y 21%, respectivamente, en comparación con la cepa HQG-3. de la cepa ATCC 31280 (Fig. 5e, Fig. complementaria 26, 27).

Dado que las cepas que sobreexpresaron los genes ALDH, FTDS o dTGD mostraron una biomasa notablemente aumentada, en comparación con la cepa de control, durante el desafío con altas concentraciones de AP-3, examinamos más a fondo la producción de AP-3 en estos recombinantes. Las cepas ATCC 31280, HQG-7, HQG-13 y HQG-17 se cultivaron en medio YMS y luego se extrajo AP-3 de los caldos de cultivo. Se determinó que los títulos de AP-3 eran 45,03 ± 0,95, 50,33 ± 5,46, 71,95 ± 6,95 mg/l y 83,47 ± 4,83 mg/l para las cepas ATCC 31280, HQG-7, HQG-13 y HQG-17, respectivamente, es decir, 11,77%, 59,78% y 85,37% el título de AP-3 aumenta por la sobreexpresión respectiva de ALDH, FDTS y dTGD (Fig. 6a, Fig. Suplementaria 28).

Efecto de la expresión mejorada de proteínas diana sobre los títulos de AP-3 en (a) la cepa de tipo salvaje ATCC 31280 y (b) la cepa de alto rendimiento WXR-24. La discrepancia se muestra como números porcentuales. ***P<0,01.

Dado el aumento de los títulos de AP-3 por la sobreexpresión de objetivos, las construcciones de sobreexpresión APASM_5765 (FDTS), APASM_6307 (dTGD) y APASM_1052 (ALDH) se introdujeron en una cepa WXR-24 de alto rendimiento de AP-3 y generaron mutantes HQG-23. HQG-24 y HQG-25, respectivamente. Después de la fermentación en medio YMV, se midieron los títulos de AP-3 y se encontró que eran 225 ± 33,25, 395,5 ± 31,02, 348,33 ± 22,49 y 254 ± 22,1 mg/L para WXR-24, HQG-23, HQG-24 y HQG-25. , respectivamente (Fig. 6b).

Los productos naturales microbianos bioactivos median funciones ecológicamente beneficiosas y pueden conferir ventajas evolutivas sobre especies rivales25. Por ejemplo, los tiopéptidos actúan como moduladores específicos de fenotipos microbianos para desencadenar la formación de biopelículas26; en concentraciones subinhibitorias, la tobramicina, la tetraciclina y la norfloxacina funcionan como moléculas de señalización para monitorear la homeostasis de las comunidades microbianas y pueden inducir la producción de compuestos bioactivos para inhibir el pastoreo de protozoos27. Sin embargo, los efectos de la biosíntesis de productos naturales sobre las cepas productoras, ya sean beneficiosas o nocivas, parecen ser en gran medida desconocidos. En nuestro trabajo, confirmamos que la biosíntesis de ansamitocinas incurrió en estrés con biomasa reducida en la cepa productora, como se muestra mediante la suplementación de AP-3 exógeno en altas concentraciones en los cultivos14 o mediante la eliminación del grupo de genes de ansamitocina en el tipo salvaje (Fig. .2b). Además, realizamos una investigación sistemática mediante simulación de estructuras y captura de proteínas de unión con una sonda de fotoafinidad derivada de AP-3, e identificamos FtsZ, la proteína citocinética del anillo Z esencial para la división celular14, y desoxitimidina difosfato glucosa-4,6 deshidratasa (dTGD), flavina. timidilato sintasa dependiente (FTDS) y aldehído deshidrogenasa (ALDH) como objetivos autóctonos de AP-3, que son en gran medida responsables del estrés causado por la biosíntesis de AP-3. Se observaron efectos de estrés similares en el patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa28 y en la bacteria marina Phaeobacter inhibens29. La P. aeruginosa PA14 de tipo salvaje productora de piocianina tuvo una tasa de muerte celular más alta en comparación con el mutante Δphz con el grupo de genes biosintéticos de piocianina eliminado, y la suplementación exógena de piocianina aumentó la tasa de muerte celular del mutante Δphz28. En Phaeobacter inhibens, la inactivación de los genes biosintéticos del ácido tropoditiético condujo a una mayor biomasa y una mayor eficiencia en el uso de carbono del mutante que del tipo salvaje29. Las comparaciones transcriptómicas y proteómicas posteriores revelaron expresiones reguladas al alza de la aminotransferasa de cadena ramificada IlvE, varios sistemas de absorción de aminoácidos y nutrientes inorgánicos, y algunos componentes de la cadena respiratoria30.

Los enfoques quimioproteómicos se han utilizado con éxito para identificar las proteínas de unión de los metabolitos primarios de la microbiota (ácidos grasos, metabolitos derivados de aminoácidos aromáticos, vitaminas, ácidos biliares, etc.)31, los ácidos micólicos en las micobacterias32, los ácidos biliares en Clostridiodes difficile33 y el hemo en Gram. -Bacterias positivas y Gram negativas34. Sin embargo, hasta donde sabemos, la quimioproteómica no se ha utilizado previamente para explorar el espectro de unión de compuestos bioactivos en los productores. Mientras que la metodología de perfilado de proteínas basado en actividad (ABPP) utiliza sondas químicas para marcar específicamente proteínas catalíticamente activas35, el enfoque de fotoafinidad explora sondas con restos fotorreactivos, como el grupo diazrina, para interactuar y formar enlaces cruzados con cualquier proteína de unión específica36. Como se muestra en nuestros experimentos, tres reacciones de entrecruzamiento para la sonda QG-YNE y las proteínas celulares dieron como resultado un etiquetado eficiente y específico con 14 proteínas capturadas compartidas (Fig. 2c), entre las cuales Asm7 tiene actividad catalítica hacia la cloroproansamitocina16 y AP- 3 probablemente ejerce efectos alostéricos sobre dTGD, FTDS y ALDH (Figs. 3d, 4d, 5d). Por lo tanto, la quimioproteómica es de hecho una estrategia poderosa para caracterizar las interacciones de compuestos bioactivos en todo el proteoma en sus productores.

Hemos desarrollado muchas estrategias genéticas para aumentar el título de AP-3, incluido el alivio de los pasos biosintéticos post-PKS que limitan la velocidad37, la atenuación de la fragmentación micelial15, la exportación mejorada de AP-3 mediante la sobreexpresión de genes de exportación38 y el fortalecimiento de la resistencia mediante la sobreexpresión del gen objetivo. proteína FtsZ14 cuyo título aumenta entre 24,94% y 93% y hasta 330,6 mg/L. En las cepas que sobreexpresaban las proteínas diana AP-3, encontramos que los títulos de AP-3 aumentaron hasta un 85% y un 76% con respecto a los niveles en la cepa de tipo salvaje ATCC 31280 y la cepa de alto rendimiento WXR-24, respectivamente (Fig. 6). Este resultado indicó que la expresión de proteínas diana en cepas productoras de antibióticos es necesaria para un antibiótico designado y debe considerarse para mejorar los títulos.

Curiosamente, mientras que la sobreexpresión de dTGD y FTDS mejoró sustancialmente la producción de AP-3, la sobreexpresión de ALDH solo promovió el crecimiento de la cepa productora y no tuvo ningún efecto sobre la producción de AP-3. ALDH oxida acetaldehído a ácido acético, que puede transformarse aún más en acetil-CoA. El acetil-CoA no solo es una molécula clave en el metabolismo central del carbono de los microbios39, sino que también se convierte enzimáticamente en unidades extensoras de malonil-CoA para la biosíntesis de AP-340. En particular, la concentración intracelular de acetil-CoA fue un 90% mayor en HQG-7 que sobreexpresa ALDH que en la cepa ATCC 31280 (Fig. 5e). Para explorar la utilización de acetil-CoA, examinamos más a fondo los intermediarios clave en el ciclo del TCA y descubrimos que las concentraciones intracelulares de ácido isocítrico y ácido cítrico aumentaron dramáticamente en un 118% y un 80%, respectivamente, en HQG-7 en comparación con la cepa ATCC. 31280. Por lo tanto, lo más probable es que el aumento del flujo de acetil-CoA en el mutante de sobreexpresión de ALDH se desvíe al ciclo de TCA y a la acumulación de biomasa, en lugar de a la biosíntesis de AP-3.

En resumen, nuestra investigación actual se concentró en la extracción de objetivos crípticos del metabolito secundario bioactivo AP-3 en su cepa de producción natural mediante el poder de la quimioproteómica y un enfoque cuantitativo basado en la EM. Se descubrió que AP-3 se unía específicamente a tres objetivos proteicos y funcionaba como su inhibidor no competitivo. Nuestros hallazgos sugirieron además que la producción de AP-3 causa un estrés fisiológico en el productor, que podría aliviarse en parte mediante la sobreexpresión de las proteínas diana. Además, al mejorar la expresión de estos objetivos también se logró una mejora del título de AP-3. Esta integración de la ingeniería y la detección de objetivos muestra un gran potencial para iluminar los efectos biológicos de los metabolitos secundarios bioactivos y sus objetivos crípticos, y para mejorar las cepas para aplicaciones industriales, incluida la producción de antibióticos.

En las tablas complementarias 1 a 4 se proporciona información detallada sobre medios de cultivo, cepas, plásmidos y cebadores. Las cepas de Escherichia coli DH10B, ET12567(pUZ8002) y BL21(DE3) se utilizaron como huéspedes para la clonación, la conjugación biparental de E. coli-Actinosynnema y la expresión de proteínas, respectivamente. Se usó el plásmido pJTU1278 para construir el mutante de alteración genética. El vector integrativo pLQ648, que contiene el promotor fuerte constitutivo kasOp*, se adaptó para sobreexpresar genes que codifican proteínas diana, y se usó pET30a para la expresión de proteínas.

Durante la fermentación, la cepa ATCC 31280 y los recombinantes se cultivaron primero en placas YMG durante 48 h a 30 °C, luego los micelios se transfirieron a medio S1 a 30 °C con agitación a 220 rpm y se cultivaron durante 24 h. Posteriormente, el cultivo S1 se inoculó en medio S2 a una concentración final de 3,3% (v/v) y se cultivó a 30 °C y 220 rpm durante otras 24 h. Finalmente, el caldo de semillas S2 se transfirió a medio YMS a una concentración final del 10 % (v/v) y se cultivó a 25 °C y 220 rpm durante 7 días para detectar la biomasa y la estimación del título de AP-3 en medios YMS/YMV.

Para el análisis cuantitativo de los títulos de AP-3 (Figura 28 complementaria), se complementó un volumen igual de metanol en los cultivos de fermentación finales y se agitó. La mezcla se sonicó durante 30 min. Luego, se recogió y centrifugó 1 ml de la mezcla, y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,22 µm y se sometió a análisis LC-MS. Para la determinación por LC-MS, las muestras se analizaron en un sistema Agilent serie 1290-MS 6230 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) equipado con una columna Agilent Eclipse Plus C18 (4,6 × 250 mm, 5 µm), con elución utilizando 45% A (H2O con 0,5% ácido fórmico): 55% B (acetonitrilo) durante 35 min y detección a 254 nm. La fuente de iones fue un modelo AJS ESI con polaridad positiva. La temperatura del gas, el flujo y la presión del nebulizador fueron 325 °C, 8 L/min y 35 psi, respectivamente. El fragmentador, el skimmer y el OCT 1 RF Vpp se configuraron a 175, 65 y 750 V, respectivamente. Todos los derivados de AP-3 fueron detectados o aislados mediante este método. La m/z de los compuestos relacionados se calculó mediante espectros de masas de alta resolución y se enumeraron en las leyendas correspondientes de la figura complementaria.

Se disolvió 20-desmetil-ansamitocina P-3 (QG-1) (46,5 mg, 0,075 mmol) en dimetilformamida anhidra (DMF) (1,0 ml) y luego K2CO3 (20 mg, 0,15 mmol) y un resto diazirina-alquino ( YNE41) (sintetizado por Bioduro-Sundia, Shanghai, China, 3,1 mg, 0,0125 mmol) se añadieron sucesivamente a la solución. Después de 1 h de agitación a 50 °C, la reacción se detectó mediante cromatografía en capa fina con fase móvil usando 95 % de diclorometano y 5 % de metanol, y se añadió YNE adicional (4,4 mg, 0,0178 mmol) a la mezcla de reacción seguido de incubación. a 50 °C durante otras 3 h en la oscuridad. La mezcla se lavó con Na2CO3 saturado y además se trató con 1 mol de HCl y salmuera. La capa orgánica se secó con Na2SO4 anhidro y luego se filtró y se concentró. El extracto crudo se purificó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para obtener el producto deseado, QG-YNE (18 mg, rendimiento del 80,6%). Los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) de 1H y 13C se registraron con un espectrómetro Bruker Advance 400 MHz en CDCl3 (RMN 1H, 400 MHz; RMN 13C, 100 MHz) utilizando tetrametilsilano como estándar interno.

El procedimiento para la captura de la proteína diana consistió en recolectar los micelios de la cepa ATCC 31280 al tercer día mediante centrifugación a 3488 × g (Thermo, TX-750), seguido de lavado con NaCl al 7%, suspensión en tampón PBS (NaCl 150 mM, KCl 3 mM, Na2HPO4 8 mM, KH2PO4 2 mM, pH 7,2–7,4) y trituración con un procesador ultrasónico. La sonda química de 10 mM (QG-YNE) se preincubó con 50 µl de lisado celular de 30 mg/ml durante 2 h y luego se irradió con luz UV a 365 nm durante otros 20/10/5 minutos en hielo para la generación de la unión covalente entre el grupo diazirina de la sonda y los residuos de aminoácidos de las proteínas diana. Las proteínas de unión a la sonda experimentaron otra reacción de clic con biotina-N3 0,5 mM asistida por Tris-hidroxipropiltriazolilmetilamina (THTPA) 0,1 mM, CuSO4 1 mM y vitamina C sódica 1 mM (NaVc). Luego, se vertieron 50 µl de perlas de estreptavidina-sefarosa (GE Healthcare) en cada muestra de reacción y se incubaron durante 16 h con rotación continua a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron con 600 µl de PBS 0,1 M, NaCl 0,5 M, urea 4,0 M y bicarbonato de trietilamonio (TEAB) 100 mM consecutivamente. Las proteínas enriquecidas se sometieron a alquilación reductora con 200 µl de Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) 10 mM y 200 µl de yodoacetamida 55 mM. Las proteínas enriquecidas se digirieron con 0,25 µg de tripsina (Promega) durante la noche a 37 °C. Las digestiones de las muestras tratadas con YNE muerto (fracción diazirina-alquino, figura complementaria 6) y QG-YNE se marcaron con reactivo de etiquetado isobárico TMT2-126 y TMT2-127 (Thermo Scientific), respectivamente. La muestra marcada se añadió a una columna analítica Thermo Acclaim PepMap RSLC (75 µM × 15 cm) y se lavó con ácido fórmico al 0,1% en H2O y acetonitrilo en 0,3 µL/min. Luego, los fragmentos peptídicos se analizaron en un espectrómetro de masas proteómico Thermo Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific)42.

El mutante knockout de asm7 HQG-1 se obtuvo de la cepa ATCC 31280 utilizando un enfoque de recombinación homóloga43. Los brazos homólogos izquierdo y derecho se amplificaron mediante PCR utilizando los pares de cebadores deasm7-LF/R y deasm7-RF/R, respectivamente. Después de la validación de la secuencia, los fragmentos de ADN se clonaron en un vector lanzadera derivado de pJTU1278 en los sitios BamHI/EcoRI y EcoRI/HindIII utilizando un kit de ligación de ADN (TaKaRa). Los plásmidos construidos se secuenciaron, se introdujeron primero en E. coli ET12567 (pUZ8002) mediante transformación y luego en la cepa ATCC 31280 mediante conjugación. Después de cultivar como césped de YMG con 0,2 mg/ml de ácido nalidíxico y tiostreptón durante 7 días a 30 °C, los exconjugantes se cultivaron adicionalmente sin tiostreptón durante dos rondas en medio sólido YMG. Luego, los mutantes de doble cruce se examinaron mediante PCR para identificar los recombinantes diana. El mutante de deleción asm7 se denominó HQG-1, y el recombinante HQG-3 con disrupción de asmA se obtuvo de la misma manera que HQG-1.

Los genes que codifican las proteínas diana se sobreexpresaron utilizando un vector integrativo derivado de pSET152 que contiene el fuerte promotor constitutivo kasOp*. Estos genes se amplificaron mediante PCR utilizando los pares de cebadores correspondientes (Tabla complementaria 3) y, después de la validación de la secuencia, los genes diana se insertaron individualmente en el vector lanzadera derivado de pSET152 en los sitios NdeI/EcoRI utilizando el kit de ligadura de ADN. Los plásmidos construidos se introdujeron primero en E. coli ET12567(pUZ8002) mediante transformación y luego en las cepas productoras ATCC 31280 o WXR-24 mediante conjugación. Después de cultivar en el césped de YMG con 0,2 mg/ml de ácido nalidíxico y apramicina durante 4 días a 30 °C, los exconjugantes se transfirieron a placas de YMG que contenían apramicina y ácido nalidíxico, se cultivaron durante 2 días y luego se validaron mediante PCR.

Para probar la tolerancia a AP-3, las cepas que sobreexpresan los genes diana (Tabla complementaria 1) y la cepa de control ATCC 31280 se cultivaron en medio sólido YMG durante 2 días. Después del cultivo sucesivo del caldo de semillas en medios S1 y S2, se transfirieron 0,15 ml de cultivos de micelio S2 (diluidos a números similares de unidades formadoras de colonias mediante detección de OD600) a placas de 24 pocillos profundos que contenían un volumen total de 1,5 ml. Medio YMS con una concentración final de 200 mg/L AP-3. La comparación de la biomasa de los recombinantes y la cepa ATCC 31280 se llevó a cabo después de 5 días de fermentación. La evaluación de la tolerancia de las cepas relacionadas contra AP-3 se determinó mediante el peso seco de las células el día 5. Además, se fermentaron HQG-7, HQG-13, HQG-17 y la cepa ATCC 31280 con una concentración final de 400 mg/L. AP-3 en los matraces de agitación de fermentación para investigar la tolerancia a AP-3.

Los genes APASM_1052, APASM_3207, APASM_5765 y APASM_6307 que codifican ALDH, Asm7, FDTS y dTGD, respectivamente, en la cepa ATCC 31280 se amplificaron mediante PCR utilizando los pares de cebadores ALDH-F/R, Asm7-F/R, FDTS-F/R y dTGD. -F/R (Tabla complementaria 3), respectivamente. Los productos de PCR obtenidos se insertaron en los sitios EcoRI/HindIII del vector pET30a para la validación de la secuenciación y los plásmidos verificados se introdujeron en E. coli BL21 para la expresión de proteínas. Las cepas de expresión heteróloga se incubaron a 37 °C y 220 rpm hasta una DO600 de 0,8 y se indujeron con isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 0,1 mM, luego se cultivaron sucesivamente durante otras 10 h a 16 °C. Las células se recogieron mediante centrifugación a 3488 x g (Thermo, TX-750), 4 °C durante 15 min, y luego el sedimento se resuspendió en los tampones correspondientes: tampón Tris-HCl (NaCl 300 mM, Tris 25 Mm, pH 8,0) para dTGD; Tampón HEPES (pH 7,5) para FDTS; y tampón Tris-HCl (pH 8,5) para ALDH. Después de la sonicación en hielo durante 10 minutos con 2 s a intervalos de 3 s, los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación a 13.800 × g (Thermo Scientific IEC MicroCL 21/21 R). y se mantuvo a 4 °C durante 30 min. Luego, el sobrenadante se aplicó a una columna de cromatografía de afinidad de níquel-NTA y se eluyó con tampón de resuspensión que contenía un gradiente de imidazol 50–250 mM. El eluyente de imidazol 250 mM se ultraconcentró a 500 µl y luego se añadió tampón de resuspensión para eliminar el imidazol, seguido de una ultraconcentración nuevamente a 500 µl. Las proteínas purificadas se verificaron mediante SDS-PAGE (Figura 11 complementaria) y se utilizaron para analizar las interacciones proteína-AP-3 y las reacciones catalíticas enzimáticas. La concentración de enzima se determinó espectrofotométricamente a 280 nm utilizando NanoDrop One (Thermo Scientific).

Las reacciones bioquímicas de dTGD se realizaron a 30 °C durante 60 min en 100 μL de tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) que contenía 0,5 μg de dTGD y NAD+ 0,5 mM con diferentes concentraciones de dTDP-D-glucosa como sustrato (0,1 , 0,16, 0,2, 0,32, 0,48, 0,64 o 0,8 mM). La reacción se terminó añadiendo 10 µl de NaOH 1 M. El producto final, dTDP-6-desoxi-D-xilo-4-hexulosa, se detectó utilizando un lector de microplacas a una longitud de onda de 320 nm para monitorear la reacción44. Los valores correspondientes de Km y Vmax se calcularon midiendo las velocidades de reacción inicial de dTGD en diferentes concentraciones de dTDP-D-glucosa. Con base en esta plataforma de análisis, se complementaron AP-3 0,31 y 0,63 mM en las reacciones para calcular las constantes de inhibición (KI) de AP-3 para dTGD.

Las reacciones de catálisis de ALDH se llevaron a cabo a 30 °C durante 60 min en 100 μL de tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,5) que contenía 2,5 μg de ALDH, KCl 100 mM y NAD+ 2 mM con 0,01, 0,02, 0,04, 0,08. , acetaldehído 0,12, 0,24, 0,48 o 0,96 mM como sustrato. Luego, se agregaron a la mezcla sal de tetrazol soluble en agua 0,1 mM (WTS-8) y metilsulfato de 1-metoxi-5-metilfenazinio (1-mPMS) 1 μM para completar las reacciones. Con el agente atrapador de electrones de 1-mPMS, WTS-8 puede reaccionar con NADH para generar formazán. La concentración de formazán se cuantificó mediante un lector de microplacas a una longitud de onda de 450 nm (A450) 45 (Figura complementaria 25). Las constantes de reacción de Km y Vmax se evaluaron mediante la absorción de A450 catalizada por ALDH para diferentes concentraciones de acetaldehído. Además, se agregaron 0,31 y 0,63 mM de AP-3 a las reacciones para calcular las constantes de inhibición (KI) de AP-3 para ALDH.

Las reacciones con FDTS se realizaron a 30 °C durante 25 minutos en 100 μL de tampón HEPES 50 mM (pH 7,5) que contenía 0,5 μg de FDTS, MgCl2 1 mM, FAD 62,5 μM y NADPH 0,6 mM con 0,1, 0,25, 0,5, 0,75. dUMP de 1, 2, 4 u 8 μM como sustrato. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de 10 µL de ácido fórmico 600 µM. Las constantes de reacción de Km y Vmax para FDTS se determinaron mediante el consumo de NADPH a NADP mediante detección A340 nm46. Además, se agregaron 0,02 y 0,04 mM de AP-3 a las reacciones para calcular las constantes de inhibición (KI) de AP-3 para FDTS.

El sistema de análisis de biosensores de resonancia de plasmones superficiales se realizó con un Biacore TM 8 K (GE Healthcare) para monitorear las interacciones biomoleculares a 25 °C. El tampón que contenía las proteínas purificadas se intercambió con PBS para evitar interferencias en la señal de detección durante la prueba. Luego, las proteínas se diluyeron a una concentración de 10 µg/ml con tampón acetato de sodio 10 mM (pH 4,0) y luego se inmovilizaron en la superficie de chips sensores CM5. AP-3 se disolvió en tampón PBS con DMSO al 0,5% y se diluyó hasta concentraciones de gradiente de 100, 50, 25, 12,5 y 6,25 µM. Durante el proceso de unión, la solución AP-3 fluyó a través de la superficie CM5 en tampón PBS a un caudal de 30 μL · min-1 durante 90 s. Luego, en el paso de disociación, se pasó tampón PBS a través de la superficie de CM5 a un caudal de 30 μL · min-1 durante 120 s para eluir AP-3. Para cada proteína purificada, se registraron las señales de respuesta de experimentos con concentraciones de gradiente de AP-3 y el software de evaluación Biacore Insight calculó la constante de afinidad (KD).

La morfología celular se caracterizó mediante microscopía electrónica de barrido (HITACHI S340II). Los micelios cosechados se lavaron tres veces con tampón PBS 0,1 M y se fijaron en glutaraldehído al 2,5% (disuelto en tampón PBS) durante 12 h. Las células fijadas se deshidrataron con concentraciones en gradiente de solución de etanol al 5%, 15%, 30%, 60%, 80%, 90%, 95% y 100% (mezclada con tampón PBS) y el etanol se eliminó usando un secador automático de punto crítico. (LEICA). Los micelios secos se fijaron sobre la plataforma de cobre con adhesivo conductor para el dorado de la superficie en una recubridora al vacío (LEICA). Las imágenes fueron capturadas con un aumento de 10 k bajo microscopía electrónica de barrido. El tamaño y la altura de la muestra se establecieron en 51 mm y 1 mm.

Se incubaron diez microgramos de proteínas recombinantes marcadas con His ALDH, FDTS y dTGD en 100 μl de tampón PBS con 10 μM de QG-YNE a temperatura ambiente durante 2 h, seguido de irradiación UV de 365 nm durante 20 min en hielo. Las proteínas marcadas con QG-YNE se separaron mediante SDS-PAGE, se extrajeron y se disolvieron en tampón NH4HCO3 50 mM. Se realizó una modificación química reduciendo con ditiotreitol 20 mM a 60 °C durante 60 min y alquilando con yodoacetamida 50 mM a 30 °C durante 30 min para reducir los enlaces disulfuro y generar una conformación abierta de las proteínas47. Luego, las muestras se digirieron con 2 μg de tripsina (Thermo Scientific) a 37 °C durante 12 h para generar fragmentos peptídicos. Las muestras de fragmentos de péptidos se desalinizaron con columnas de desalinización Ziptip (Pierce) y se resuspendieron en 10 µl de ddH2O que contenía ácido fórmico al 0,1 % después de secarlas por evaporación. Las muestras finales se analizaron utilizando un espectrómetro de masas proteómicas Thermo Easy nLC1200/Q Exactive plus para identificar los residuos de aminoácidos unidos por la sonda de fotoafinidad.

Después de tres días de fermentación, se recogieron los micelios y se analizaron cuantitativamente los metabolitos intracelulares. Específicamente, se recogieron 25 ml de caldo de fermentación y se centrifugaron a 6200 x g (Thermo, F15-6 x 100y). durante 12 min. Los micelios se lavaron tres veces con 25 ml de tampón PBS. Luego, los micelios lavados se resuspendieron en 25 ml de agua destilada y se dividieron en partes iguales en 5 tubos, seguido de una centrifugación a 13.800 × g (Thermo Scientific IEC MicroCL 21/21 R). durante 5 min y eliminación del sobrenadante. Luego, se agregaron 2,5 ml de solución de extracción que contenía 45% de acetonitrilo, 45% de metanol y 10% de ácido acético glacial, y el sedimento celular se resuspendió y se sonicó durante 15 minutos. Después de dos extracciones, la mezcla combinada se centrifugó a 13.800 × g (Thermo Scientific IEC MicroCL 21/21 R). durante 5 minutos, y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,22 µm y se recogió para el análisis de los metabolitos intracelulares. Todos los pasos anteriores se realizaron a 4 °C o en hielo.

El análisis cuantitativo de acetil-CoA se realizó utilizando una LC-MS 1260-QQQ 6470 (Agilent) con una columna Eclipse-C18 (4,6 × 250 mm, 5 μm, Agilent) a un caudal de 0,5 ml/min con 2 Volumen de inyección en µL. La fase móvil estaba compuesta por (A) acetato de amonio 20 mM en agua Milli-Q con un pH de 7,4 y (B) metanol. Los metabolitos se eluyeron mediante gradiente de fase móvil de la siguiente manera: 0 a 5 min, 2% B; 5 a 15 min, 2 % B a 50 % B; 15 a 20 min, 90% B; 20 a 25 min, 90 % B a 2 % B; y 25–30 min, 2 % B. El análisis cuantitativo de ácido cítrico, ácido isocítrico y dTMP se realizó utilizando un sistema ACQUITY UPLC H-Class y un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Xevo TQ-XS (Waters, Milford, MA, EE. UU.) con ACE Excel C18-PFP (100 × 2,1 mm, 1,7 μm, Phenomenex) a un caudal de 0,3 ml/min con un volumen de inyección de 1 μl. Se usaron agua y acetonitrilo, ambos con ácido fórmico al 0,1%, como fases móviles A y B, respectivamente, con un gradiente lineal de 1-100% B en 10 minutos.

Los metabolitos se escanearon mediante el modo de monitoreo de reacciones múltiples (MRM) con una velocidad de 0,01 s/exploración y un voltaje capilar establecido en 1 kV. La temperatura de la fuente se mantuvo a 150 °C mientras que la del gas de desolvatación fue de 450 °C. Los caudales del gas de desolvatación (nitrógeno) y del gas de cono (argón) fueron 900 y 50 L/h, respectivamente. Se detectó acetil coenzima A en los modos de iones positivos y MRM. Se detectaron dTMP, ácido cítrico y ácido isocítrico en modos de iones negativos y MRM. Las curvas de calibración y la señal cuantitativa MRM para la cuantificación de dTMP se muestran en la figura complementaria 21; para acetil-CoA, en la figura complementaria 26; para ácido cítrico y ácido isocítrico, en la figura complementaria 27. El voltaje del cono (V) y la energía de colisión (eV) de acetil-CoA, ácido cítrico, ácido isocítrico y dTMP se establecieron en 20/15, 20/15, 20/ 20 y 15/20, respectivamente.

El modelado de proteínas se realizó con AlphaFold v2.1.148 y ranking_0.pdb, que contenía la predicción con la mayor confianza y se seleccionó para análisis posteriores. Todas las proteínas se modelaron tanto en formato monómero como en formato homomultímero. Para determinar los estados oligo, se utilizaron secuencias amino de ALDH, FDTS y dTGD para buscar en la base de datos PDB (//www.rcsb.org/) y se analizaron proteínas homólogas. ALDH se alineó con 5gtl con una identidad de secuencia del 43%, que forma un homotetrámero. FDTS y dTGD se alinearon con 3hzg y 1r66, que forman un homotetrámero y un homodímero, respectivamente, con identidades de secuencia del 72% y el 70%, respectivamente. Las estructuras de las proteínas fueron analizadas por PyMol (Versión 2.3.0)49.

La estructura molecular de AP-3 se obtuvo de la base de datos PDB (PDB ID: 7e4p). Se empleó AutoDock Tools50 para convertir archivos moleculares y de proteínas en pdbqt con átomos de hidrógeno polares añadidos. El acoplamiento molecular se realizó mediante AutoDock Vina 1.2.351 con AP-3 y proteínas diana como ligando y receptores, respectivamente. Al mismo tiempo, la exhaustividad del argumento se fijó en 32 para dar un resultado de acoplamiento más fiable. Los sitios de unión de AP-3 fueron visualizados por PyMol (Versión 2.3.0). Las interacciones de enlaces de hidrógeno y las interacciones hidrofóbicas entre AP-3 y las proteínas se analizaron mediante LigPlot+ (Versión v2.2.5)52 (Figuras complementarias 14, 19 y 24).

Se realizó la prueba ANOVA unidireccional para el análisis estadístico de biomasa, longitud del micelio, título de AP-3 y concentraciones de metabolitos intracelulares. P ≥ 0,1, P < 0,1, P < 0,05 y P < 0,01 se definieron como insignificante, significativo, moderadamente significativo y altamente significativo, respectivamente. Se utilizó la fórmula CONFIDENCE.T en Excel para estimar el intervalo de confianza del 95% de la media. Se empleó la d de Cohen para calcular el tamaño del efecto de la media. Se utilizaron tres réplicas biológicas independientes para los experimentos de medición de biomasa y cuantificación de metabolitos, mientras que se eligieron cinco muestras para la medición de la longitud del micelio. Se midieron una vez los efectos de AP-3 y la sonda QG-YNE sobre la tasa de crecimiento de la cepa indicadora de levadura. Se midieron por una vez las interacciones entre AP-3 y desoxitimidina difosfato glucosa-4,6 deshidratasa (dTGD), timidilato sintasa dependiente de flavina (FDTS) y aldehído deshidrogenasa (ALDH). Se utilizaron tres réplicas biológicas independientes en la medición constante de Michaelis-Menten de tres proteínas diana.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos principales que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el artículo y en sus archivos de información complementaria. Los conjuntos de datos generados y analizados durante este artículo están disponibles a pedido de los autores correspondientes. Los datos de origen subyacentes a los gráficos y tablas proteómicas se cargan como Datos complementarios 1 y 2. Las secuencias de todos los genes descritos en este manuscrito están disponibles en las bases de datos de GenBank con los números de acceso CP073249.1. Los datos de proteómica de espectrometría de masas se depositaron en el Consorcio ProteomeXchange a través del repositorio de socios PRIDE con el identificador de conjunto de datos PXD043867.

Berdy, J. Metabolitos microbianos bioactivos: una opinión personal. J. Antibiot. 58, 1–26 (2005).

Artículo CAS Google Scholar

Izaki, K., Matsuhashi, M. & Strominger, JL Glicopéptido transpeptidasa y D-alanina carboxipeptidasa: reacciones enzimáticas sensibles a la penicilina. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 55, 656–663 (1966).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sabatini, DM, Erdjument-Bromage, H., Lui, M., Tempst, P. & Snyder, SH RAFT1: una proteína de mamífero que se une a FKBP12 de forma dependiente de rapamicina y es homóloga a los TOR de levadura. Celda 78, 35–43 (1994).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Drewes, G. & Knapp, S. Quimioproteómica y sondas químicas para el descubrimiento de objetivos. Tendencias Biotecnología. 36, 1275-1286 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Staub, I. & Sieber, SA Betalactámicos como sondas químicas selectivas para el etiquetado in vivo de enzimas bacterianas implicadas en la biosíntesis de la pared celular, la resistencia a los antibióticos y la virulencia. Mermelada. Química. Soc. 130, 13400–13409 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Sol, L. et al. La rapamicina se dirige a STAT3 e influye en c-Myc para suprimir el crecimiento tumoral. Química celular. Biol. 29, 373–385 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Peterson, E. & Kaur, P. Mecanismos de resistencia a los antibióticos en bacterias: relaciones entre los determinantes de resistencia de los productores de antibióticos, las bacterias ambientales y los patógenos clínicos. Frente. Microbiol. 9, 2928 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Ezekiel, DH y Hutchins, JE Mutaciones que afectan la ARN polimerasa asociadas con la resistencia a la rifampicina en Escherichia coli. Naturaleza 220, 276–277 (1968).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Floss, HG & Yu, TW Rifamicina: modo de acción, resistencia y biosíntesis. Química. Rev. 105, 621–632 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Zhang, HZ, Schmidt, H. & Piepersberg, W. Clonación molecular y caracterización de dos genes de resistencia a lincomicina, lmrA y lmrB, de Streptomyces lincolnensis 78-11. Mol. Microbiol. 6, 2147–2157 (1992).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Prota, AE et al. Un nuevo sitio de unión a tubulina y farmacóforo para fármacos anticancerígenos que desestabilizan los microtúbulos. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 111, 13817–13821 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Venghateri, JB, Gupta, TK, Verma, PJ, Kunwar, A. & Panda, D. La ansamitocina P3 despolimeriza los microtúbulos e induce la apoptosis uniéndose a la tubulina en el sitio de vinblastina. Más uno 8, e75182 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cassady, JM, Chan, KK, Floss, HG y Leistner, E. Desarrollos recientes en los agentes antitumorales maitansinoides. Química. Farmacéutica. Toro. 52, 1–26 (2004).

Artículo CAS Google Scholar

Wang, XR, Wang, RF, Kang, QJ & Bai, LQ El agente antitumoral ansamitocina P-3 se une a la proteína de división celular FtsZ en Actinosynnema pretiosum. Biomoléculas 10, 699 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, YT, Kang, QJ, Zhang, LL & Bai, LQ Ingeniería de morfología involucrada con subtilisina para mejorar la producción de antibióticos en actinomicetos. Biomoléculas 10, 851 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Spiteller, P. y col. Los pasos de modificación post-policétido sintasa en la biosíntesis del agente antitumoral ansamitocina por Actinosynnema pretiosum. Mermelada. Química. Soc. 125, 14236–14237 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Tanida, S., Hasegawa, T., Hatano, K., Higashide, E. y Yoneda, M. Ansamitocinas, antibióticos antitumorales maitansinoides. organismo productor, fermentación y actividades antimicrobianas. J. Antibiot. (Tokio) 33, 192–198 (1980).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Wang, WS et al. Un fuerte promotor diseñado para Streptomycetes. Aplica. Reinar. Microbiol. 79, 4484–4492 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kaminski, L. & Eichler, J. N-glicosilación de Haloferax volcanii: delineación de la vía de biosíntesis de dTDP-ramnosa. Más uno 9, e97441 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Van der Beek, SL et al. Enzimas de biosíntesis de dTDP-L-ramnosa estreptocócicas: caracterización funcional e identificación de compuestos principales. Mol. Microbiol. 111, 951–964 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Little, K., Tipping, MJ y Gibbs, KA El desarrollo de células enjambradoras de la bacteria Proteus mirabilis requiere el gen conservado de biosíntesis del antígeno común enterobacteriano rffG. J. Bacteriol. 200, e00230–18 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Becker, HF y cols. Dinámica de interacción del sustrato y control de oxígeno en el sitio activo de la timidilato sintasa ThyX. Bioquímica. J. 459, 37–45 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Singh, S. y col. Aldehído deshidrogenasas en respuestas celulares al estrés oxidativo/electrófilo. Radical libre. Biol. Medicina. 56, 89-101 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Jackson, B. y col. Actualización sobre la superfamilia del gen de la aldehído deshidrogenasa (ALDH). Tararear. Genómica 5, 283–303 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Firn, RD & Jones, CG Productos naturales: un modelo sencillo para explicar la diversidad química. Nat. Pinchar. Representante 20, 382–391 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Bleich, R., Watrous, JD, Dorrestein, PC, Bowers, AA y Shank, EA Los antibióticos tiopéptidos estimulan la formación de biopelículas en Bacillus subtilis. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 112, 3086–3091 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Romero, D., Traxler, MF, López, D. y Kolter, R. Los antibióticos como moléculas señal. Química. Rev. 111, 5492–5505 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Meirelles, LA y Newman, DK Los efectos tanto tóxicos como beneficiosos de la piocianina contribuyen al ciclo de vida de Pseudomonas aeruginosa. Mol. Microbiol. 110, 995–1010 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Will, SE et al. Los límites del crecimiento: carga energética del antibiótico endógeno ácido tropoditiético en Phaeobacter inhibens DSM 17395. Plos One 12, e0177295 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Wünsch, D. y col. Respuesta global de Phaeobacter inhibens DSM 17395 a la eliminación de su cromido de 262 kb que codifica la síntesis de antibióticos. Microbio. Fisiol. 30, 9-24 (2020).

Artículo PubMed Google Scholar

Zhao, XH, Yang, XL y Hang, HC Análisis quimioproteómico de objetivos y mecanismos de metabolitos-proteínas de la microbiota. Bioquímica 61, 2822–2834 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kavunja, HW y cols. Sondas de glicolípidos fotoactivables para identificar interacciones micolato-proteína en micobacterias vivas. Mermelada. Química. Soc. 142, 7725–7731 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Forster, ER, Yang, X., Tai, AK, Hang, HC y Shen, AM Identificación de un factor de transcripción de unión a ácidos biliares en Clostridioides difficile mediante proteómica química. Química ACS. Biol. 17, 3086–3099 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Wilkinson, IVL, Bottlinger, M., El Harraoui, Y. & Sieber, SA Perfilado de los proteomas de bacterias que se unen al hemo mediante proteómica química. Angélica. Química. En t. Ed. ingles. 62, e202212111 (2023).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Keller, LJ, Babin, BM, Lakemeyer, M. & Bogyo, M. Perfiles de proteínas basados ​​en actividades en bacterias: aplicaciones para la identificación de objetivos terapéuticos y caracterización de comunidades microbianas. actual. Opinión. Química. Biol. 54, 45–53 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Wright, MH Proteómica química de las interacciones huésped-microbio. Proteómica 18, e1700333 (2018).

Artículo PubMed Google Scholar

Ning, XJ, Wang, XR, Wu, YT, Kang, QJ & Bai, LQ Identificación e ingeniería de cuellos de botella posteriores a la modificación de PKS para mejorar el título de ansamitocina P-3 en Actinosynnema pretiosum subsp. pretiosum ATCC 31280. Biotecnología. J. 12 https://doi.org/10.1002/biot.201700484 (2017).

Wang, XR y cols. Identificación e ingeniería de eflujo para la producción de ansamitocina P-3 en Actinosynnema pretiosum. Aplica. Microbiol. Biotecnología. 105, 695–706 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Pietrocola, F., Galluzzi, L., Bravo-San Pedro, JM, Madeo, F. & Kroemer, G. Acetil coenzima A: metabolito central y segundo mensajero. Metabolismo celular. 21, 805–821 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Milke, L. & Marienhagen, J. Ingeniería de la disponibilidad de malonil-CoA intracelular en huéspedes microbianos y su impacto en la síntesis de policétidos y ácidos grasos. Aplica. Microbiol. Biotecnología. 104, 6057–6065 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, ZQ y cols. Diseño y síntesis de fotoentrecruzadores de diazirina que contienen alquinos terminales minimalistas y su incorporación en inhibidores de quinasas para la elaboración de perfiles de proteomas basados ​​en células y tejidos. Angélica. Química. En t. Ed. 52, 8551–8556 (2013).

Artículo CAS Google Scholar

Li, WC y cols. Desarrollo de sonda de fotoafinidad para el descubrimiento de la ruta de biosíntesis de glucósidos de esteviol en Stevia rebuadiana y detección rápida de sustratos. Química ACS. Biol. 13, 1944-1949 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Li, Y. et al. Las carbamoilaciones duales en el resto policétido y glicosilo por Asm21 dan como resultado una biosíntesis extendida de ansamitocina. Química. Biol. 18, 1571-1580 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Shi, XX, Sha, SS, Liu, LK, Li, X. & Ma, YF Un ensayo en placa de microtitulación de 96 pocillos para la detección de alto rendimiento de inhibidores de la dTDP-D-glucosa 4,6-deshidratasa de Mycobacterium tuberculosis. Anal. Bioquímica. 498, 53–58 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Li, CZ y cols. El catabolismo de los aminoácidos regula la proteostasis de las células madre hematopoyéticas a través del eje GCN2-eIF2α. Célula madre celular 29, 1119–1134 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Sarkar, A. y col. La timidilato sintasa de Mycobacterium tuberculosis (ThyX) es un objetivo de la plumbagina, un producto natural con actividad antimicobacteriana. Más uno 15, e0228657 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhou, YQ y cols. La proteómica química revela que CD147 es un objetivo funcional del ácido pseudolárico B en células cancerosas humanas. ChemComm 53, 8671–8674 (2017).

CAS Google Académico

Saltador, J. et al. Predicción de estructura de proteínas de alta precisión con AlphaFold. Naturaleza 596, 583–589 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schrodinger, LLC, El sistema de gráficos moleculares PyMOL, versión 1.8. (2015).

Ravindranath, PA, Forli, S., Goodsell, DS, Olson, AJ y Sanner, MF AutoDockFR: avances en el acoplamiento proteína-ligando con flexibilidad del sitio de unión especificada explícitamente. Más Computadora. Biol. 11, e1004586 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Eberhardt, J., Santos-Martins, D., Tillack, AF & Forli, S. AutoDock Vina 1.2.0: nuevos métodos de acoplamiento, campo de fuerza ampliado y fijaciones de Python. J. química. inf. Modelo. 61, 3891–3898 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Laskowski, RA & Swindells, MB LigPlot+: múltiples diagramas de interacción ligando-proteína para el descubrimiento de fármacos. J. química. inf. Modelo. 51, 2778–2786 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Descargar referencias

Dedicamos este artículo a la memoria de nuestro difunto colega, el profesor Youli Xiao. Reconocemos los primeros esfuerzos de Youli Xiao para sintetizar la sonda de fotoafinidad y realizar el análisis quimioproteómico. Agradecemos los útiles comentarios del Prof. Shenying Li de la Universidad de Shandong y del Prof. Ningyi Zhou de SJTU. Agradecemos a las instalaciones centrales y al centro de servicio técnico de SLSB y al centro de análisis instrumental de SJTU por la recopilación de datos. Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (subvenciones n.° 2021YFC2100600 y 2019YFA0905400), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención n.° 31830104) y la Comisión de Ciencia y Tecnología de la municipalidad de Shanghai (subvenciones n.° 19JC1413000 y 19430750600) a LB

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Qianjin Kang, Linquan Bai.

Laboratorio Estatal Clave de Metabolismo Microbiano, Centro Conjunto de Innovación sobre Resistencias Antibacterianas de Shanghai-Islamabad-Belgrado, Facultad de Ciencias de la Vida y Biotecnología, Universidad Jiao Tong de Shanghai, Shanghai, 200240, China

Qungang Huang, Xin Zhang, Ziyue Guo, Xinnan Fu, Yilei Zhao, Qianjin Kang y Linquan Bai

Laboratorio Internacional Conjunto de Investigación de Ciencias Metabólicas y del Desarrollo, Universidad Jiao Tong de Shanghai, Shanghai, 200240, China

Qungang Huang, Xin Zhang, Ziyue Guo, Xinnan Fu, Yilei Zhao, Qianjin Kang y Linquan Bai

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

LQB y QGH concibieron el proyecto. LQB, QJK y QGH diseñaron los experimentos. QGH, XZ, XNF y ZYG realizaron los experimentos. QGH, QJK, YLZ y LQB analizaron los datos. QGH, QJK, YLZ y LQB escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Qianjin Kang o Linquan Bai.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Zhiqiang Cai, Constance B. Bailey y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales: [Tobias Goris y Anam Akhtar]. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado al autor(es) original(es) y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Huang, Q., Zhang, X., Guo, Z. et al. La biosíntesis de ansamitocina P-3 genera estrés en la cepa productora Actinosynnema pretiosum en múltiples objetivos. Común Biol 6, 860 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05227-w

Descargar cita

Recibido: 26 de abril de 2023

Aceptado: 07 de agosto de 2023

Publicado: 18 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05227-w

Cualquier persona con la que comparta el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, actualmente no hay un enlace para compartir disponible para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenidos Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.